利用TALEN技术制备HE4（WFDC2）敲除小鼠模型*

龙华洋 孙 丹 李金萍 江世文，3

（1.首都医科大学基础医学院遗传与发育生物学系，北京 100069）（2.第四军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心，西安 710038）（3.基础医学系，默索大学医学院，纪念健康医学中心，妇科与妇产科系，萨凡纳，GA，美国，31404）（4.常州大学制药与生命科学学院，常州 213164）

人附睾蛋白 4（Human epididymis protein 4，HE4）最初是在人附睾中被发现，并因此而得名[1]。此后HE4被证明是由人 Wfdc2（WAP four-disulfide core domain protein 2）基因编码的一种分泌蛋白，因此HE4又名为 WFDC2[2]。另有研究报道，除了在人附睾中表达外，HE4也在其他正常组织器官中有表达，包括生殖系统，呼吸系统，并且HE4在气管中表达最高，其余依次唾液腺，肺等组织[3-4]。

近年来，越来越多的研究指出，HE4在一些癌症中高表达，包括卵巢癌[3，5-7]，肺癌[8-11]，子宫内膜癌[12]。因此认为HE4可以作为检测这些癌症的标志物。在HE4相关癌症的研究中，HE4与卵巢癌的研究最受研究者关注。目前，CA125的含量仍然是检测卵巢癌的金标准[13]，Hellstrom等[5]用卵巢癌患者血清中的 HE4水平来检测卵巢癌，其结果与CA125有相同的灵敏性，并且用HE4作为检测指标能提高恶性肿瘤检测的特异性。Ghasem i[14]和Zhao等[15]指出，CA125联合 HE4检测可以提高卵巢癌检测的敏感性和特异性。研究指出，HE4可能是促进卵巢癌细胞[16-17]和子宫内膜癌细胞[18]增殖的一个激活因子。而且，在癌细胞裸鼠异种移植实验中，过表达HE4的肿瘤体积明显大于对照组肿瘤[17]。上述研究提示，HE4高表达与肿瘤增殖有关，但是在正常组织中，HE4缺失的影响以及它正常的生理功能仍然不清楚。

基因敲除小鼠模型是研究动物基因功能的重要工具之一，小鼠的基因组与人类基因组相似度达90%，有99%的基因与人类基因同源[19]，并且表达HE4蛋白的人Wfdc2在如小鼠等一些物种间高度保守[3]，但目前尚无 WFDC2敲除小鼠模型来研究HE4的正常生理功能。

基因敲除技术的传统方法是通过同源重组获得基因敲除的ES细胞，然后通过嵌合体技术获得基因敲除动物[20]，近几年来兴起的基因编辑工具包括锌指核酸酶 ZFN技术[21]，转录激活因子样效应物核酸酶TALEN技术[22]，成簇规律间隔的短回文重复序列CRISPR以及CRISPR相关蛋白系统CRISPR/Cas9技术[23]。本研究采用TALEN技术敲除C57BL/6 J小鼠Wfdc2基因，首次获得WFDC2敲除小鼠模型，并发现纯合WFDC2敲除小鼠出生后短时间内死亡，为进一步研究HE4的正常生理功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物由北京生命科学研究所转基因动物中心提供。使用许可证号：SYXK（京）2015-002。所有实验小鼠均在SPF级动物房饲养和繁殖。温度控制在 22℃，湿度 70%，自动光周期（12 h明/12暗），自由采食和饮水。

1.2 主要试剂

Golden Gate TALEN assembly合成的质粒（Addgene），10X T4 DNA ligase buffer（NEB），T4 DNA ligase（NEB），限制性内切酶 Bsa I（NEB），Sac I，Esp3I（Fisher）质粒小提试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、T载体试剂盒、mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Life Technologies）。

1.3 TALENs位点设计

根据 NCBI上小鼠 Wfdc2基因序列，利用TALEN在线设计工具（http：//tale-nt.cac.cornell.edu）设计基因敲除位点。TALENs敲除靶序列如下：TALEN-L靶向序列5'-GCA CCA TGC CTG CCT G-3'，TALEN-R靶向序列 5'-AGT AGG AGG CCA GCG GC-3'。中间的 spacer序列为 5'-TCG CCT CTG CTT GCT G-3'。

1.4 TALENs载体构建

采用Golden gate法将识别靶序列的RVD模块构建到载体上。然后将TALEN片段通过 Esp3I酶切构建到pCAG-T7-TALEN载体上，使得TALEN表达有 CAG或者 T7启动子启动，其中 CAG启动TALENs在动物细胞中表达，T7启动 TALENs体外转录成mRNA。将测序正确的TALENs表达载体采用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒备用。

1.5 体外转录

Sac I酶切 TALENs无内毒素质粒，电泳回收片段，并进行纯化。以纯化片段为模板，采用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit进行体外转录合成多聚腺苷酸化的mRNA。将体外转录的稳定mRNA用NucAway Spin Columns纯化回收并用显微注射缓冲液稀释到100ng/μL，-80℃保存备用。

1.6 TALENs显微注射及活性验证

将WFDC2的TALEN-L和 TALEN-R mRNA混合在一起后在显微镜（Nikon）下利用显微操作系统（Eppendorf）注射到15枚 C57BL/6 J的受精卵中，培养3.5 d后挑选出存活的囊胚，混合一起用裂解液裂解，以裂解液为模板，以上游引物：5'-TGTGCTTCCTACCCGCCTCCT-3'和下游引物：5'-CCCGCTCCTCTTCATCAGGTCTC-3'进行PCR扩增，并采用T7E1进行酶切鉴定，其中扩增片段大小为413 bp，酶切片段为120 bp+293 bp。验证 TALENs有切割活性后，按照上述方法，获得显微注射受精卵，将其移植到ICR代孕雌鼠输卵管内。

1.7 突变检测及基因型分析

取1周龄小鼠脚趾提取基因组DNA，同时进行编号，按照酶切鉴定方法对F0代小鼠进行基因型鉴定，并将T7E1酶切鉴定为阳性的小鼠的PCR扩增产物连接到T载体上，进行测序和突变基因分析。将Wfdc2基因发生移码突变的F0代小鼠单独建系，最后得到Wfdc2纯合双敲除小鼠。1

.8 WFDC2敲除小鼠表型分析

对WFDC2敲除小鼠的出生情况进行观察分析，记录每一窝的出生胎鼠数量，基因型比例以及存活情况。

2 结果

2.1 TALEN载体构建

小鼠Wfdc2基因有五个已知转录变异体，为了高效敲除WFDC2蛋白表达，本研究选择的敲除位点为 Wfdc2基因的第一个外显子区域，如图 1。TAL-effector识别模块 HD、NG、NI、NN分别识别碱基C、T、A、G，因此本研究中识别 Wfdc2的模块序列分别为5'-NN HD NIHD HD NING NN HD HD NG NN HD HD NG NN-3'和TALEN-R 5'-NINN NN NI NN NN HD HD NINN HD NN NN HD HD NI-3'。采用Golden gate的方法[24]获得了 TALENs体外转录模板，如图2。

2.2 WFDC2敲除小鼠构建及鉴定

图1 Wfdc2基因敲除TALENs位点Fig.1 The TALENs binding site in the m ouse Wfdc2 gene

图2 Wfdc2 TALENs识别臂的构建Fig.2 The construction of Wfdc2 TALENs tem p late

体外转录分别得到 TALEN-L和TALEN-R的mRNA。将mRNA分别稀释到100ng/μL后等量混合进行胞质注射，先注射15枚受精卵，进行TALENs活性验证（图3），验证TALENs有切割活性后，共注射140枚受精卵，移植131枚到5只ICR代孕雌鼠输卵管中，共出生24只小鼠。对出生的24只F0代小鼠进行鉴定，鉴定结果显示，有9只敲除阳性小鼠（图4），选取第24号 F0代阳性小鼠继续繁育最终获得敲除17个碱基的Wfdc2纯合双敲除模型。

2.3 WFDC2敲除小鼠的表型分析

得到24号F0代阳性小鼠后，我们将它与野生型小鼠交配，F1代留下敲除17个碱基的杂合WFDC2敲除小鼠（WFDC2+/-），这些杂合小鼠能正常生长，和野生型小鼠生长情况并无明显的差别，WFDC2+/-小鼠自交，能正常怀孕产仔得到F2代小鼠，根据孟德尔第一定律，F2代小鼠中将出现野生型（WFDC2+/+），杂合（WFDC2+/-）及纯合（WFDC2-/-）小鼠，并且 WFDC2+/+∶WFDC2+/-∶WFDC2-/-的比例应为1∶2∶1。但是在 F2代小鼠出生后5 d我们对F2代小鼠编号及基因型鉴定时发现，存活的F2代小鼠中没有发现WFDC2-/-小鼠，只发现 WFDC2+/+和 WFDC2+/-。这一结果说明WFDC2-/-小鼠可能胚胎致死或者出生后死亡。

图4 鉴定Wfdc2基因发生切割的小鼠Fig.4 Restriction digest of PCR p roducts used for identification of m ice carrying-induced m utations of the Wfdc2 gene

为验证 WFDC2-/-小鼠是否胚胎致死，我们对7只胚胎 18.5 d（E18.5）WFDC2+/-孕鼠进行剖腹产，发现E18.5 d孕鼠腹中胎儿中有 WFDC2-/-小鼠，并且未见死胎，其中野生型占总出生数量的29.58%，WFDC2+/-占 46.48%，WFDC2-/-占23.94%（表1），接近孟德尔第一定律1∶2∶1的比例。这一结果提示，WFDC2-/-小鼠可能在出生后死亡，经过仔细观察追踪，我们发现，每窝新生胎儿中，都有一些新生小鼠尸体或残骸，怀疑有的可能被母鼠吃掉。接着，我们对这些尸体或残骸进行基因型鉴定，发现这些死去的胎鼠是WFDC2-/-小鼠。为了防止母鼠将新生 WFDC2-/-小鼠吃掉，我们将刚出生的胎鼠立即与母鼠分开，对不同 WFDC2+/-自交所产生6窝新生小鼠出生情况进行统计，其中50%的新生WFDC2-/-小鼠在5 h之内死亡，所有新生WFDC2-/-小鼠在18 h内死亡，而 WFDC2+/-小鼠和WFDC2+/+小鼠能正常存活下来（图5）；在这些胎鼠中，WFDC2+/+占总出生数量的 23%，WFDC2+/-占 52%，WFDC2-/-占 25%（表 2），接近孟德尔第一定律；而 WFDC2+/-自交后代每窝平均产仔数和WFDC2+/+自交后代每窝平均产仔数之间没有显著差异（图 6）。上述结果说明非纯合WFDC2敲除小鼠和野生型小鼠一样具有正常的生长发育和生殖繁育能力，而纯合 WFDC2敲除小鼠能够正常出生，并在出生后死亡。

图5 新生小鼠24 h内生存曲线Fig.5 Survival curve for WT、hetero and KO fetus after birth w ithin 24 hours

表1 E18.5天胎鼠基因型分布情况Tab le 1 Genotype distribution of em bryos from E18.5

表2 新生小鼠基因型分布Tab le 2 Genotype distribution of neonatal from P0

图6 WFDC2+/-自交后代每窝平均产仔数和WFDC2+/+自交后代每窝平均产仔数Fig.6 Summ ary of litter sizes born from WFDC2+/+and WFDC2+/-

3 讨论

现今基因组编辑技术突飞猛进，在TALEN基因编辑技术之后，又出现了CRISPER-Cas9基因编辑技术，因其操作周期短，效率高而被广泛使用[23，25]。而TALEN也因其相对操作简单，特异性高等特点，仍被广泛应用于动植物等的基因编辑。本研究通过胞质注射TALEN mRNA的方法获得了Wfdc2基因发生移码突变的F0代小鼠，将该种小鼠单独建系，繁育和培养，最后获得纯合的WFDC2敲除模型小鼠。

现今有关WFDC2功能的研究，特别是它在肿瘤发生过程中所起作用的研究越来越受人重视。许多研究都指出卵巢癌，肺癌等组织中HE4有异常高表达，并提出 HE4可以作为这些癌症的检测指示物。但HE4的高表达是促进癌症的发生还是由于癌症的发生而导致HE4的高表达这个问题仍然没有定论。在目前的研究更倾向于HE4高表达促进癌症的发生。Zhu等[16]通过沉默卵巢癌细胞中HE4的表达，发现这些癌细胞的增殖及迁移能力随HE4的减少而降低，指出HE4的表达可能是维持肿瘤细胞增殖、迁移的因子，并且Moore等[17]通过在卵巢癌细胞中高表达HE4，证明HE4促进卵巢肿瘤的发生。但是 Gao等[26]和 Kong等[27]却指出 HE4在肿瘤中起着抑制癌细胞增殖和迁移的作用。因此现阶段关于HE4是否促进肿瘤的发生的结论还需要更多的研究来证实。WFDC2除了在肿瘤组织中有高表达外，它在正常组织中也有表达。在人体正常组织中表达量从高到低的器官依次是气管，唾液腺，肺；而在小鼠正常组织中表达量从高到低的器官依次是肺，肾等[4]器官，这些研究结果提示HE4可能参与调控体内相关正常生理活动。

本研究发现WFDC2纯合敲除小鼠出生后死亡，而非纯合WFDC2敲除小鼠能正常生长和繁育。可能的原因是：1）.纯合WFDC2敲除小鼠在孕鼠母体内能够获得来自母体血液的WFDC2，而出生后由于缺乏母体和自身合成的WFDC2而死亡。而非纯合小鼠由于未全部失去自身合成WFDC2的能力而能在出生后正常存活并生长发育。有趣的是，WFDC2在一些物种中高度保守[3]，成熟WFDC2蛋白分子量在13kD，在被糖基化修饰后为27kD左右，至于27kD的WFDC2是否能透过胎盘屏障而到达胎儿体内还有待实验验证。2）.WFDC2表达可能具有时空性，在胚胎发育期或胚胎发育早期，WFDC2不参与相关生理活动，在小鼠出生后 WFDC2参与并维持正常生理活动，而纯合敲除小鼠由于缺乏WFDC2表达而不能实现相关生理功能正常进行，最终导致死亡。本实验首次通过实验证明WFDC2参与调控小鼠正常生理活动，提示 WFDC2可能在维持胎儿正常生理功能中起着重要的作用，同时，通过研究HE4正常生理功能的作用机制，能更好的帮助我们理解它们在癌症发生中所起的作用。因此，本研究获得的WFDC2敲除小鼠是研究WFDC2生理功能的良好模型。