超高效液相色谱串联质谱法测定饲料中纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、环天冬氨酰苯丙氨酸、甜蜜素、安塞蜜、糖精钠

■李延山

（辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁沈阳110016）

人工合成的甜味剂有纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、环天冬氨酰苯丙氨酸（BDPA）、甜蜜素、安塞蜜、糖精钠等，其中阿力甜、阿斯巴甜、环天冬氨酰苯丙氨酸、甜蜜素、安塞蜜未列入饲料添加剂目录，存在非法添加的风险；纽甜、糖精钠是饲料中允许使用的甜味剂，饲料企业对于购置的纽甜、糖精钠有较强的质控需求。因此制定饲料中纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、BDPA、甜蜜素、安塞蜜、糖精钠的检测标准既能满足监管工作需要，也能服务于饲料企业，具有较大的社会效益。

采用液相色谱串联质谱法检测6种人工合成的甜味剂（即纽甜、阿斯巴甜、甜蜜素、安赛蜜、糖精钠、阿力甜）及降解产物BDPA。回收率在75%～100%之间，RSD＜15%，方法检测限为150 μg/kg，定量限为500 μg/kg，检测限、定量限还可进一步降低优化。标准线性工作范围为：100～5 000 μg/l。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

样品：玉米、豆粕、猪配合饲料、猪浓缩饲料、牛羊精补料、复合预混合饲料、维生素预混合饲料。

试剂：甲酸、甲醇、乙腈均为色谱级，乙酸铅（分析纯），超纯水。

固相萃取小柱：HLB固相小柱，3 ml/60 mg。

仪器：液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾电离源。

标准品：纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、BDPA、甜蜜素、安塞蜜、糖精钠对照品，纯度≥98%。

储备液配制：精确称取纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、甜蜜素、安塞蜜、糖精钠对照品，用0.2%甲酸水溶液配成浓度约为0.1 mg/ml的标准储备液，2～8℃冷藏保存，有限期6个月。

1.2 仪器参数条件

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱：C18(100 mm×2.1 mm，粒径1.7 μm)，或其他效果等同的C18柱；柱温：40 ℃；进样量：5 μl；流动相及流速见表1；流速：0.3 ml/min。

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子模式；检测方式：多反应监测；脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最佳灵敏度；定性离子对、定量离子对及对应的保留时间、锥孔电压和碰撞能量见表2。

表1 流动相及流速

表2 纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、BDPA、甜蜜素、安塞蜜、糖精钠的定性、定量离子对及保留时间、锥孔电压、碰撞电压的参考值

1.3 试验方法

1.3.1 提取

称取2 g（精确到0.000 1 g）试样于50 ml离心管中，准确加入19 ml甲酸水提取液和1 ml饱和醋酸铅溶液，充分震荡15 min，超声提取15 min，然后于7 000 r/min离心10 min，上清液备用。

1.3.2 净化

固相萃取小柱先用3 ml乙腈、3 ml甲酸水提取液活化。取上清液3 ml过柱，用3 ml甲酸水提取液淋洗，空气抽干2 min，用3 ml乙腈洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发(50℃)至干,用3.0 ml 0.2%甲酸水溶液溶解，过0.22 μm滤膜后上机测定。若样品液中含有的甜味剂浓度超出线性范围，进样前可用一定体积的0.2%甲酸水溶液稀释，使稀释后上机液的甜味剂浓度在线性范围内。

2 结果与讨论

2.1 提取液的选择

这7种甜味剂均易溶于水溶液，其中阿斯巴甜和BDPA在碱性条件下极易降解，因此提取液选择偏酸性的水溶液。又因为饲料的蛋白质会影响检测结果，因此加入一定的蛋白沉淀剂。最终确定为19 ml 0.2%甲酸水溶液+1 ml饱和醋酸铅溶液。

2.2 固相净化柱的选择

这7种甜味剂总体看是极性较弱的物质，分别考察了HLB柱、C18柱、硅胶柱、以及MAX柱，结果表明，HLB柱具有较好的选择性。

2.3 色谱条件的优化

对常用的流动相甲醇-水和乙腈-水进行了比对，试验结果表明，甲醇-水信号值略高，但峰形较差，因此选择乙腈-水。又将0.1%甲酸水溶液与20 mmol氨水水溶液作比较，发现流动相中含有20 mmol氨水水溶液时，有拖尾的现象；流动相中含有0.1%甲酸水溶液时，各组分的响应值都比较高，而且峰形较好，无拖尾现象。因此，本试验采用0.1%甲酸水溶液-乙腈做流动相。图1为0.1%甲酸水溶液-乙腈做流动相的色谱图(TIC)。

2.4 质谱条件的优化

采用ESI-的多级监测模式。综合比较ESI+与ESI-两种模式下的目标物信号值。糖精钠是强电离的阴离子，不适合ESI+模式，因此综合考虑采用ESI-模式，并得到特征离子（见表2）及优化后的7种甜味剂混合标准溶液的选择性离子检测监测质谱图见图2。

2.5 线性关系

配制系列浓度的纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、BDPA、甜蜜素、安塞蜜、糖精钠对照品工作液：分别吸取7种甜味剂储备液，置于容量瓶中，用0.2%甲酸水溶液稀释成浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/ml的标准曲线。标准曲线相关系数R2均在0.99以上。

2.6 回收率试验

为进一步考察方法的适用性，以玉米、豆粕、猪配合饲料、猪浓缩饲料、牛羊精补料、复合预混合饲料、维生素预混合饲料为空白试样，加标量分别为2.0、4.0、10.0 mg/kg。试验的回收率在80%～105%。

2.7 精密度试验

图1 0.1%甲酸水溶液-乙腈做流动相的7种甜味剂色谱图

N=5条件下，考察方法的精密度，RSD小于15%。

2.8 检测限与定量限

信噪比=3确定为方法的检测限，信噪比=10确定为方法的定量限。经试验确定本方法检测限为150 μg/kg，定量限为500 μg/kg。

3 结论

建立了采用超高效液相色谱串联质谱法测定饲料中纽甜、阿力甜、阿斯巴甜、环天冬氨酰苯丙氨酸、甜蜜素、安塞蜜、糖精钠。该方法快速、高效、准确，可同时检测饲料中7种甜味剂，定量限为500 μg/kg，能在7 min内完成样品的分析。为政府部门监管提供了技术支撑，也为企业对原料和产品的质控提供了方法。

（参考文献刊略，需者可函索344600835@qq.com）