米曲霉和枯草芽孢杆菌对羽毛粉降解效果研究

■杨 刚 杨国浩 管军军 尹清强

（1.河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001；2.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002）

羽毛粉蛋白质含量丰富[1]，但其结构稳定，不溶于水，不能被一般的蛋白酶水解，难以被动物消化吸收。随着饲料蛋白资源的日益短缺和价格飞速上涨，利用微生物的作用，将羽毛角蛋白进行降解，既可节省能源、保护环境，还可得到优质的饲料蛋白原料产品[2-3]。本试验选取可用于降解羽毛粉的米曲霉和枯草芽孢杆菌菌株，对其降解羽毛粉的效果进行分析和比较，为羽毛粉的生物降解和营养价值提升研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

羽毛粉和麸皮由河南德邻生物制品有限公司提供，产蛋白酶的米曲霉（Aspergililus oryzae）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）由河南农业大学生物技术与动物营养研究室提供。

1.2 培养基

1.2.1 羽毛粉培养基Ⅰ

羽毛粉2 g、葡萄糖2 g、氯化钠0.5 g、氯化钙0.05 g、氯化锌0.1 g、水 90 ml。

1.2.2 羽毛粉培养基Ⅱ

羽毛粉9 g、麸皮1 g、氯化钙0.05 g、氯化锌0.1 g、水8 ml。

所有培养基均需在121℃和1×105Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min。

1.3 试验方法

1.3.1 米曲霉和枯草芽孢杆菌在羽毛粉培养基中产蛋白酶活力测定

枯草芽孢杆菌接种于羽毛粉培养基Ⅰ中，37℃振荡培养72 h后，3 000 r/min条件下离心15 min，取上清液，测定酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶活力。米曲霉接种于羽毛粉培养基Ⅱ中，30℃静置培养72 h，加入100 ml灭菌生理盐水，静置30 min后过滤，得到上清液，测定酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶活力。每个试验3个重复。

蛋白酶活力测定按照GB/T 23527—2009方法执行（下同）。蛋白酶活力单位定义为每克固体酶粉或每毫升液体酶，在1 min水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸，即为一个蛋白酶活力单位，以U/g（U/ml）表示。

1.3.2 米曲霉和枯草芽孢杆菌对羽毛粉的降解效果

将米曲霉孢子接种于高压灭菌处理的羽毛粉培养基Ⅱ中，30 ℃静置培养，分别在培养24、48、72、96 h和120 h取样，制取上清液，测定中性蛋白酶活力和可溶性蛋白含量。每个试验变量3个重复。

将枯草芽孢杆菌接种于高压灭菌处理的羽毛粉培养基Ⅰ中，37℃振荡培养，分别在培养24、48、72、96、120 h取样，离心取上清液，测定中性蛋白酶活力和可溶性蛋白含量。每个试验变量3个重复。

可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法[4]测定。

1.3.3 米曲霉发酵羽毛粉上清液的SDS-PAGE凝胶电泳检测

依照尚宏丽等[5]方法进行电泳检测：配制15%的分离胶和5%的浓缩胶，上样15 μl进行电泳，浓缩胶中以80 V电压电泳，待样品通过浓缩胶之后，调高电压至120 V直至电泳结束。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色液染色过夜，脱色用考马斯亮蓝脱色液直至脱色完全。

1.4 数据处理

试验数据结果以“平均数±标准差”表示，采用SPSS 18.0软件进行方差分析和显著性检验，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 米曲霉和枯草芽孢杆菌在羽毛粉培养基中产蛋白酶活力(见表1)

表1 米曲霉和枯草芽孢杆菌在羽毛粉培养基中蛋白酶活力测定

从表1可以看出，在羽毛粉作为唯一氮源的培养基中，米曲霉和枯草芽孢杆菌中性蛋白酶活力显著高于酸性蛋白酶和碱性蛋白酶活力，其中酸性蛋白酶活力最低（P＜0.05），因而后续试验以中性蛋白酶活力作为测定指标。

2.2 米曲霉和枯草芽孢杆菌对羽毛粉降解效果

表2 米曲霉发酵羽毛粉不同时间中性蛋白酶活力测定

表2为米曲霉接种到羽毛粉培养基中时，不同时间中性蛋白酶活力的测定结果。从表2可以看出，米曲霉发酵羽毛粉时，分泌的蛋白酶活力在72 h前随时间延长而快速升高，在72 h达到最大值，之后缓慢下降，72 h时蛋白酶活力达到3 256.61 U/g，与其他时间蛋白酶活力测定结果差异显著（P＜0.05）。

表3 米曲霉发酵羽毛粉不同时间可溶性蛋白含量测定

表3为不同时间米曲霉发酵羽毛粉的可溶性蛋白含量的变化。由表3可以看出，在米曲霉发酵羽毛粉时，羽毛粉可溶性蛋白含量在培养初期显著提高，在48 h时达到最高值（362.07 mg/g），与其余时间可溶性蛋白含量差异显著（P＜0.05）。

表4 枯草芽孢杆菌发酵羽毛粉不同时间中性蛋白酶活力

表5 枯草芽孢杆菌发酵羽毛粉不同时间可溶性蛋白含量测定

表4和表5为枯草芽孢杆菌发酵羽毛粉时，中性蛋白酶活力和可溶性蛋白含量的变化情况。从表中可以看出，枯草芽孢杆菌发酵羽毛粉时，分泌的蛋白酶酶活力在72 h达到最大（690.03 U/g）；而羽毛粉可溶性蛋白含量随培养时间的延长逐渐升高，48 h以后差异不显著（P＞0.05）。

2.3 米曲霉发酵羽毛粉上清液的SDS-PAGE凝胶电泳

对米曲霉发酵羽毛粉的可溶性蛋白进行SDSPAGE凝胶电泳检测，结果如图1所示。从图1可以看出，48 h时羽毛粉中可溶性蛋白含量达到最高，之后快速下降。72 h之后有明显的蛋白酶条带。

图1 羽毛粉可溶性蛋白的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳

3 讨论

3.1 羽毛粉降解菌产蛋白酶种类

本试验对筛选出的米曲霉和枯草芽孢杆菌产生的酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶活力进行测定，两种菌在羽毛粉培养基中生成的中性蛋白酶活力显著高于酸性蛋白酶和碱性蛋白酶活力（P＜0.05），而且碱性蛋白酶活力显著高于酸性蛋白酶活力（P＜0.05），说明在以羽毛粉为唯一氮源和诱导物情况下，米曲霉和枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶以中性蛋白酶和碱性蛋白酶为主，与之前的研究结果一致[6]。

3.2 米曲霉和枯草芽孢杆菌对羽毛粉的降解效果

本试验将米曲霉或枯草芽孢杆菌接种在以羽毛粉为唯一氮源的培养基中，以蛋白酶活力和可溶性蛋白含量为指标，研究米曲霉和枯草芽孢杆菌对羽毛粉的降解效果。蛋白酶活力的升高表明微生物可以有效利用羽毛粉作为氮源生长，并分泌蛋白酶对羽毛粉进行降解。可溶性蛋白含量的提高表明羽毛粉在微生物作用下，羽毛粉中的肽键被分泌的蛋白酶破坏，蛋白质被逐步降解为小分子量蛋白质。本试验中，米曲霉分泌的蛋白酶活力最高可达3 256.61 U/g，枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶活力最高可达690.03 U/g，表明两种微生物均可以有效降解羽毛粉，利用羽毛粉作为氮源生长。

米曲霉发酵羽毛粉时，可溶性蛋白含量由最初的2.21 mg/g提高到48 h的362.07 mg/g，表明在米曲霉作用下，羽毛粉中有36%左右的角蛋白被降解为可溶性蛋白，可以更好地被动物消化吸收。枯草芽孢杆菌发酵羽毛粉时，48 h时可溶性蛋白含量为11.45 mg/g，96 h时可溶性蛋白含量最高达到12.04 mg/g，与48 h之前相比差异显著(P＜0.05)，但48 h以后可溶性蛋白含量变化不大。从米曲霉和枯草芽孢杆菌对羽毛粉降解的试验结果来看，两种微生物均可以对羽毛粉起到一定的降解作用，其中米曲霉的降解效果更为明显。

3.3 米曲霉发酵羽毛粉上清液的SDS-PAGE凝胶电泳

SDS-PAGE电泳结果说明，米曲霉发酵羽毛粉时，24 h时羽毛粉中可溶性蛋白含量较低，表明羽毛粉蛋白质主要以角蛋白形式存在，且不溶于水，48 h时羽毛粉中可溶性蛋白含量显著升高，表明米曲霉产生的蛋白酶开始降解羽毛粉，羽毛粉角蛋白结构被破坏，水溶性提高，随着蛋白酶的增加，蛋白酶将羽毛粉中大分子蛋白进一步降解为小分子蛋白质、多肽或氨基酸，48 h后羽毛粉中大分子蛋白含量明显降低。

4 结论

本试验结果表明米曲霉和枯草芽孢杆菌均可以对羽毛粉角蛋白进行降解，最佳发酵时间为72 h，此时米曲霉发酵羽毛粉蛋白酶酶活力达到3 256.61 U/g，枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶活力最高可达690.03 U/g，两者之中米曲霉对羽毛粉的降解效果较好。