响应面法优化大曲中黄曲霉毒素B1提取工艺

张崇军，唐贤华*，赵 龙，朱克永，周 文，隋 明，舒学香

（1.四川工商职业技术学院，四川 都江堰 611830；2.成都市华测检测技术有限公司，四川 成都 610041）

黄曲霉毒素（aflatoxin，AFT）主要是指由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒的次生代谢产物，广泛存在于农作物及食物中，黄曲霉毒素被世界卫生组织（world health organization，WHO）的癌症研究机构划定为“Ⅰ”类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，对人及动物肝脏组织具有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至造成机体死亡[1-4]。目前，分离得到的AFT及其衍生物已有20多种，其中毒性和致癌性最大的是黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）[5-7]。主要危害包括对人体细胞的致癌作用、细胞毒性、对免疫系统的损害、肝脏细胞的毒性等。由于黄曲霉毒素对水稻、玉米、小麦等粮食作物有着很强的侵染性[8]，且大曲主要是以小麦、大麦、豌豆等粮食作物为原料，故大曲存在黄曲霉毒素污染的可能性[9]。近年来白酒安全问题不断涌现，俗话说“曲为酒之骨”[10]，因此做好大曲生产过程中黄曲霉素的检测对确保白酒质量安全，保障消费者健康很有必要。

目前关于黄曲霉毒素B1的提取方法主要包括超声波处理、振荡、微波处理、均质和紫外线辐射等，林耀盛等[11]采用微波处理的方法提取米糠中的黄曲霉毒素B1，取得了较好的效果；王洪健等[12]采用紫外辐照处理来提取花生油中黄曲霉毒素B1；龚珊等[13]为了测定玉米中黄曲霉毒素B1，对超声、振荡、高速均质3种样品前处理提取方法的提取效果进行了比较分析；毕春元等[14-15]选择了超声波处理的方法分别对花生和蚕豆中的黄曲霉毒素B1进行了提取和工艺参数的优化，为黄曲霉毒素B1的检测提供了可靠的方法。为了加强大曲中黄曲霉毒素的溶解度和扩散，有利于毒素的提取完全，综合安全和经济性等方面的考虑，本研究采用超声波处理从大曲中提取黄曲霉毒素B1，结合Plackett-Burman试验设计和响应面分析法优化提取条件以建立最适的提取方案来确立有效和准确的检测参数，为提高大曲安全性，进一步保障浓香型白酒的生产安全奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

中高温大曲：取自川南某制曲厂，贮存期为30d，取样后密封保存。

1.1.2 试剂

甲醇、二氯甲烷、无水硫酸钠（均为分析纯）：成都科龙化工试剂厂；酶联免疫试剂盒（96孔/48孔）：北京华安麦科生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

F50型酶标仪：瑞士Tecan公司；SB-5200DTD型超声波提取仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；DZKW-S-8型电热恒温水浴锅：北京市光明医疗仪器有限公司；SORVALL Stratos型高速离心机：美国Thermo公司；φ15 cm快速定性滤纸：泰州市奥克滤纸厂。

1.3 方法

1.3.1 大曲中AFB1的提取[16]

准确称取粉碎混匀的大曲样品10.00g，通过20目筛，置于250 mL具塞锥形瓶中，分别加入80 mL不同体积分数的甲醇-水溶液，在不同的温度条件下，采用不同的超声波功率提取不同的时间后，用快速定性滤纸过滤于锥形瓶中。吸取10 mL滤液于分液漏斗中，加入40 mL二氯甲烷，加塞振摇5 min，静置分层（约30 min），弃下层相，再加入10 mL二氯甲烷于分液漏斗中，重复提取，合并二氯甲烷相，经盛有约20 g预先用二氯甲烷润湿的无水Na2SO4滤纸漏斗过滤于锥形瓶中，以65℃水浴烘干，冷却后加入10 mL体积比为1∶1的甲醇-水溶液，即为待测样品。

1.3.2 AFB1的检测

按照参考文献[17]中酶联免疫法检测大曲中AFB1的含量。

1.3.3 AFB1提取工艺优化单因素试验

根据1.3.1，初始超声功率为200 W、超声时间为20 min、超声温度为30℃。采用单因素轮换法，依次考察甲醇溶液体积分数（45%、55%、65%、75%、85%）、超声功率（140 W、160 W、180 W、200 W、220 W）、提取时间（15 min、20 min、25 min、30min、35min）、提取温度（20℃、30℃、40℃、50 ℃、60℃）4个因素对大曲中AFB1提取率的影响。采用酶联免疫法测定AFB1浓度，平行试验3次，确定最佳提取工艺条件。

1.3.4 AFB1提取工艺优化响应面试验

在单因素试验结果的基础上，采用4因素3水平的Box-Behnken响应面试验设计法[14-18]，以甲醇溶液体积分数（A）、超声波功率（B）、提取时间（C）和提取温度（D）为考察因素，以黄曲霉毒素B1的得率（Y）为评价指标，优化大曲中AFB1的提取工艺。

1.3.5 数据统计与分析

运用Design-Exper（tVersion 8.0.6）软件对数据进行回归拟合，作出响应曲面图，并进行线性回归和方差分析。

2 结果与分析

2.1 AFB1提取工艺优化单因素试验

2.1.1 甲醇溶液体积分数对AFB1提取效果的影响

甲醇溶液体积分数对大曲中AFB1的提取效果的影响见图1。

图1 甲醇溶液的体积分数对黄曲霉毒素B1提取效果的影响Fig.1 Effect of methanol solution volume fraction on the extraction effect of aflatoxin B1

由图1可知，不同体积分数的甲醇溶液对AFB1提取效果影响较大，随着甲醇溶液体积分数的提高，AFB1得率不断增大，当甲醇溶液的体积分数为55%时，AFB1的得率达到最大值，为2.27 μg/kg，之后又逐渐下降，出现这种现象的原因可能是随着料液比的增加，固液接触面积和浓度梯度增加，有利于大曲中的AFB1内向外扩散，使得AFB1得率增加。当料液比继续增加，醇溶性的杂质溶解度增加，使AFB1的溶解被抑制，因此确定甲醇溶液的最佳体积分数为55%。

2.1.2 超声波功率对AFB1提取效果的影响

超声波功率对大曲中AFB1的提取效果的影响结果见图2。

图2 超声波功率对黄曲霉毒素B1提取效果的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction effect of aflatoxin B1

由图2可知，当超声波功率范围为140～200W时，AFB1得率随着超声波功率的增大不断增加，说明黄曲霉毒素的提取率在不断提高；当超声波功率为200 W时，AFB1的得率达到最大值，为2.33 μg/kg，继续升高超声波功率，AFB1得率逐渐降低，分析原因可能是随着超声波频率增大，温度升高，有利于大曲中其他醇溶性杂质的溶出，影响黄曲霉毒素B1的测定。因此，综合考虑确定最适超声波功率为200 W。

2.1.3 提取时间对AFB1提取效果的影响

提取时间对大曲中AFB1的提取效果的影响结果见图3。

图3 提取时间对黄曲霉毒素B1提取效果的影响Fig.3 Effect of the extraction time on the extraction effect of aflatoxin B1

由图3可知，提取时间为15～25 min时，AFB1得率随提取时间的延长增长速率较快；当提取时间为25 min时，AFB1的得率达到最大值，为2.58 μg/kg，分析原因可能是由于黄曲霉毒素在甲醇/水溶液中的溶解度随着时间的延长而增大，同时由于萃取过程中温度升高，提取液黏度减少，扩散系数增加，促使提取速度加快。提取时间过度延长，使得提取温度过高，杂质的溶出量增加，使黄曲霉毒素的检测受到干扰，另一方面成本费用增大，造成溶剂损失，影响环保。综合各方面因素考虑，确定黄曲霉毒素B1的最佳提取时间为25 min。

2.1.4 提取温度对AFB1提取效果的影响

提取温度对大曲中AFB1的提取效果的影响结果见图4。

图4 提取温度对黄曲霉毒素B1提取效果的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction effect of the aflatoxin B1

由图4可知，提取温度为20～30℃时，AFB1得率随提取温度的升高逐渐提高；当提取温度为30℃时，AFB1得率达到最大值2.43 μg/kg，提取温度再增加，AFB1得率呈缓慢下降的趋势，这是因为温度升高后使AFB1结构发生改变，同时杂质的浸出量也增加，从而影响了提取效果。因此，确定黄曲霉毒素B1的最适提取温度为30℃。

2.2 AFB1提取工艺优化响应面试验

2.2.1 响应面分析试验设计方案

在单因素试验的基础上，选取甲醇溶液体积分数（A）、超声波功率（B）、提取时间（C）、提取温度（D），以黄曲霉毒素B1得率（Y）为响应值。利用Minitab软件进行Box-Behnken试验设计[18]，其因素与水平见表1，试验设计及结果见表2。

表1 AFB1提取工艺优化响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for AFB1 extraction process optimization

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

2.2.2 回归方程的建立及显著性分析

利用Design-Expert8.06软件对试验结果进行多元回归拟合，得到二次多项回归模型方程：

对该模型进行方差分析，结果见表3。

表3 回归方程的方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

由表3可知，回归方程模型P值为0.000 1＜0.01，表明该方程拟合度较好。失拟项P值为0.219＞0.05，表明失拟项不显著，模型不失拟，选择合理。该模型的相关系数R2=0.9406，说明该模型能解释94.06%响应值的变化，校正决定系数R2adj=0.871 3，说明该模型拟合程度较好[19]，试验误差较小，因此可用此模型对大曲中AFB1的提取工艺条件进行分析和预测。

根据回归方程一次项系数绝对值的大小，可知影响大曲中AFB1提取效果的主次因素为B（超声波功率）＞A（甲醇溶液体积分数）=D（提取温度）＞C（提取时间）[20]。模型的一次项A、B、C、D对结果影响均不显著（P＞0.05）；二次项A2、B2、D2、C2对结果影响均极显著（P＜0.01）；交叉项AB、AC、BC对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响均不显著（P＞0.05）。

2.2.3 AFB1提取工艺优化响应面分析

各个因素间的交互作用对大曲中AFB1提取效果影响的响应曲面图及其等高线图见图5。

等高线的形状反映出交互效应的强弱大小，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则与之相反[21]。由图5可知，甲醇溶液体积分数、超声波功率、提取时间和提取温度间的交互作用对大曲中AFB1提取效果的影响均出现抛物面型关系，所得到的响应面都存在一个极大值点，其中甲醇溶液体积分数、超声波功率、提取时间分别与提取温度的交互作用等高线呈椭圆形，对结果影响显著（P＜0.05）。

图5 甲醇溶液体积分数、超声波功率、提取时间和提取温度对AFB1提取效果影响的响应面和等高线Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interactions between methanol solution volume fraction,ultrasonic power,extraction time and temperature on the extraction effect of AFB1

经过响应面优化，根据拟合二阶模型公式得到理论上大曲中黄曲霉毒素B1的最佳提取工艺条件为甲醇溶液体积分数54.91%，超声波功率199.44 W，提取时间24.86 min，提取温度29.83℃，在此最优条件下，AFB1得率的理论值为2.59 μg/kg。考虑到实际操作的可行性，将上述最优条件修订为甲醇溶液体积分数55%，超声波功率200 W，提取时间25 min，提取温度为30℃。

2.2.4 验证试验

为了验证该模型的有效性及实用性，在此最佳提取条件下对该模型做3次验证试验，结果测得AFB1得率为2.58 μg/kg，与预测结果基本一致，因此，该模型能较好地预测实际AFB1的提取状况。

3 结论

本研究在单因素试验的基础上，选取甲醇溶液体积分数、超声波功率、提取时间和提取温度4个因素，利用Design-Expert8.0.6软件进行4因素3水平的Box-Behnken中心组合设计，通过响应面优化得到大曲中AFB1的最佳提取工艺条件：甲醇溶液体积分数55%，超声波功率200 W，提取时间25min，提取温度为30℃。在此最优条件下，大曲中AFB1的得率为2.58 μg/kg。