不同杀菌方式对低醇枣酒品质的影响

张丽华，李珍珠，王维静，刘梦培，王小媛，葛珍珍，纵 伟*

（1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450002；2.食品生产与安全河南省协同创新中心，河南郑州 450002；3.河南省冷链食品质量安全控制重点实验室，河南 郑州 450002）

红枣是中国特有的经济果品，占全球红枣总产量的90%以上。红枣的可溶性固形物含量高（干枣60%～80%，鲜枣25%～30%），可发酵糖约是葡萄的3～4倍，是微生物发酵酿酒及酿醋的优良水果资源之一[1-4]。近年来，随着人们健康意识的加强，发酵型果蔬低醇饮料以其酒精度低、营养丰富和口感好等特点越来越被消费者所接受和喜爱。然而，关于低醇饮料的概念暂没有统一的标准。欧盟视酒精含量≤1.0%vol的酒精饮料为低醇饮料；德国则规定酒精含量＜1.5%vol；在中国，乙醇含量＜0.5%vol的啤酒是无醇啤酒，乙醇含量在0.5%vol～2.5%vol是低醇啤酒[5]。大部分关于低醇饮料的报道指出[6-8]，酒精含量＜7.0%的果酒或饮料即可定义为低醇产品。这主要是相较于NY/T1508—2017《绿色食品果酒》果酒行业标准中对果酒酒精度的论述而言的：果酒是以葡萄以外的新鲜水果或果汁为原料，经全部或部分发酵酿制而成的发酵酒，酒精度一般在7%vol～18%vol[9]。

枣酒是以红枣浆（或汁）为原料，接入酵母菌发酵制成的果酒，兼有酒香和枣香的独特风味，是红枣深加工的重要途径之一。目前，国内外对枣酒的研究主要集中在枣酒发酵工艺优化及品质分析[1-2，10-11]、质量控制[3，12]、发酵过程中成分变化[13-15]以及专用酵母菌筛选[16]等方面。然而，关于果酒酿造过程中杀菌方式的研究并不多见。亚硫酸盐是目前果酒酿造过程常用的防腐抗氧化剂[17]，广泛应用于葡萄酒和各种果酒的加工中[18]。虽然亚硫酸盐防腐效果明显，但若处理不当，容易产生尖酸味道，导致果酒口味变差，严重的还会危害硫不耐症及高敏人群的健康，甚至促使哮喘病患者旧疾复发[19]。为此，研究新的果酒杀菌技术或工艺，对提高果酒的安全性意义重大。WYK S等[20]研究了SO2处理、高压处理和脉冲电磁场处理对红葡萄酒的感官、酒香酵母活力和其他品质参数的影响，发现在一年的贮藏过程中，高压处理能保持酒中的微生物平衡，并对口感没有显著影响。FERRER-GALLEGO R等[21]采用复合的物理和化学添加剂（富含谷胱甘肽、壳聚糖、二甲基碳酸酯和不同水解缩合单宁组成的灭活干酵母组成）取代SO2加工生产西班牙著名的丹魄（Tempronillo）和阿尔巴里诺（Albariño）无硫葡萄酒，结果表明，采用这种处理加工出的无硫葡萄酒可以满足消费者对健康葡萄酒的需求。也有采用臭氧、沙棘叶绿体方法[19]等来降低葡萄酒中亚硫酸盐的残留量的报道。本研究主要围绕不同的杀菌方式（亚硫酸盐、高压杀菌、巴氏杀菌和高压微射流（highpressuremicrofluidization，HPM））处理对枣酒发酵中各项品质指标的影响，以期为生产更为安全的发酵型低醇枣酒提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红枣（品种为灰枣）：市售；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GIM 2.137：广东省微生物菌种保藏中心。

没食子酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；果胶酶（100 000 U/g）、纤维素酶（200 000 U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司；麦芽汁培养基、麦芽汁琼脂培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；福林酚试剂：北京索莱宝科技有限公司；抗坏血酸、2,2联吡啶、N-乙基顺丁烯二酰亚胺（N-ethylmaleimide，NEM）（均为分析纯）：阿拉丁化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

KYH-777多功能食品搅拌机：佛山市乐创网络科技有限公司；AL204型电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；BC/BD-429H型冰柜：青岛海尔股份有限公司；HC-3618R型高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；SW-CJ-2D型超净工作台：苏州净化设备有限公司；SC-80C型全自动色彩色差计：北京康光光学仪器有限公司；PAL-1数显折光糖度仪：日本Atago公司；PHS-3C型酸度计：上海雷磁仪器厂；BPH-9272型精密恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；HH-S4型恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SHB-3循环水多用真空泵：郑州杜甫仪器厂；T6紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵枣酒的工艺流程及操作要点

红枣汁的酶解：红枣经清洗、去核后，切成小块，按照料液比1∶6（g∶mL）进行打浆（pH为5.31），将红枣浆移入容器中，放入磁力搅拌器中（40℃），加入果胶酶和纤维素酶（质量比1∶2）酶解4 h[22]。酶解后的枣浆采用200目的纱布进行过滤，将过滤得到的枣汁于6 000 r/min的条件下，4℃离心20 min，收集上清液得到澄清枣汁（可溶性固形物含量为8%），灌装于玻璃饮料瓶中，每瓶灌装200 mL。

杀菌：分别采用巴氏杀菌（95℃、15 min）、高压杀菌（115℃、10min）、超高压微射流（160MPa，处理2次）和亚硫酸氢钠杀菌（NaHSO3，60mg/L）4种杀菌方式处理枣汁，以不进行杀菌处理的枣汁为对照，每种杀菌处理选用10瓶枣汁。

酿酒酵母的活化与扩大培养：在无菌条件下，取安瓿管保存的酿酒酵母冻干粉，滴入0.1～0.2 mL无菌水溶解，待安瓿瓶内的菌粉溶解成悬浮状，吸取全部菌悬液接入灭菌冷却后的麦芽汁液体培养基中，在26℃培养24h后，取出，摇匀。移取此培养液1 mL，接入灭菌冷却后的麦芽汁液体培养基（100 mL）中，在同样条件下培养，得到扩大培养的酿酒酵母菌悬液（6.8×108CFU/mL），备用。

接种、发酵：杀菌处理结束后，每瓶接种1.5%的酵母菌培养液，于26 ℃进行发酵，分别在发酵0、2 d、4 d、6 d和8 d时取出，进行指标的测定。

1.3.2 测定方法

pH值：采用pH计测定；酒精度：采用酒精比重计法测定。

红枣汁的可滴定酸：参照GB 5009.239—2016《食品酸度的测定》中的方法[23]。移取10 mL红枣汁，置于150 mL锥形瓶中，加入煮沸冷却至室温的蒸馏水，加入2mL酚酞指示液，混匀后，用0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，至出现粉红色30s内不褪色为终点，记录所消耗的体积。按下式计算：

式中：TA为样品的酸度，°T；c为NaOH标准溶液的物质的量浓度，mol/L；V1为滴定时所消耗NaOH标准溶液体积，mL；V0为空白实验所消耗NaOH标准体积，mL；100为100 mL试样；V2为试样的体积，mL；0.1为酸度理论定义NaOH的物质的量浓度，mol/L。

色差：采用全自动色彩色差计测定红枣汁的明亮度（L*值）和绿/黄值（a*值正值表示黄色，a*值负值表示绿色；b*正值表示黄色，b*负值表示蓝色）。

抗坏血酸含量：按照参考文献[24]的方法进行测定；总酚含量：按照参考文献[25]的方法进行测定；多糖含量：按照参考文献[26]的方法进行测定；蛋白质含量：按照参考文献[27]的方法进行测定。

感官评价：采用9分制的评分方法，邀请30名学生参照表1的感官评价标准进行品评，无记名打分。要求品评者分别从色泽、口感、香气和整体接受性4个方面进行评价。

表1 低醇枣酒的感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standards of low-alcohol jujube wine

2 结果与分析

2.1 不同杀菌方式对发酵枣酒pH值和可滴定酸含量的影响

由图1A可知，随着发酵时间的延长，枣酒的pH值逐渐下降，在发酵第8天时，采用HPM杀菌和巴氏杀菌的枣酒保持了较高的pH值（分别为4.17和4.16），显著高于对照组（3.99）、高压灭菌组（4.13）和NaHSO3组（3.96）（P＜0.05）。对照组和添加NaHSO3组的pH值下降较快，主要是由于对照组并未进行灭菌处理，导致杂菌的出现污染了枣酒，促使pH值下降。而添加NaHSO3的枣酒，由于NaHSO3的加入，增加了发酵基质的酸度，从而引起pH值的降低[28]。

由图1B可知，低醇枣酒中可滴定酸的变化趋势与pH值的变化趋势呈对应性关系。随发酵时间的延长，可滴定酸含量逐渐升高，这与枣酒中的糖类成分被酵母菌发酵利用，代谢产生了酸类物质有关。枣酒中的酸类物质，部分来源于原料，另一部分来源于发酵过程中酵母代谢产生，如草酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等[14]。在发酵第6天和第8天时，对照组的可滴定酸含量显著高于其他组（P＜0.05），表明枣酒中可能滋生了产酸菌，从而导致可滴定酸含量的增加。而采用高压杀菌和HPM处理的枣酒，其可滴定酸含量要显著低于对照（P＜0.05）。采用巴氏杀菌和添加NaHSO3的枣酒，在发酵前4 d没有显著差异（P＞0.05）。第6天时，添加NaHSO3的枣酒可滴定酸含量最高，显著高于其他组（P＜0.05）。表明添加NaHSO3的枣酒在发酵6d后，发酵基质的酸度由于NaHSO3的加入而升高了，从而导致可滴定酸含量增高。依据发酵酒的生产原则，对于优质的原料SO2用量控制在40～60mg/L，霉变原料SO2用量控制在60～80mg/L，陈酿酒SO2用量则控制在20～30 mg/L[28]。有些果酒在酿造过程中，SO2需要分次添加，只添加一次可能控制不住杂菌的生长。因此，采用SO2抑菌的措施，要注意使用次数和用量的问题，否则可能会产生杂菌。

图1 不同杀菌方式对发酵低醇枣酒pH值（A）和可滴定酸含量（B）的影响Fig.1 Effect of different sterilization methods on pH value(A)and titratable acid content(B)of fermented low-alcohol jujube wine

2.2 不同杀菌方式对发酵枣酒色差的影响

果酒的色泽一般与原料有直接的关系，枣酒的色泽主要呈暗红色或略带浅棕色，具体的色差值如表2所示。从枣酒的明亮度（L*）变化可以看出，在发酵过程中，经高压杀菌后发酵的枣酒，L*显著低于其他组（P＜0.05）。表明高压杀菌显著降低了枣酒的明亮度，可能是由于在高温高压条件下，枣汁的还原糖和氨基酸发生了美拉德反应，形成了褐色的物质，从而导致枣酒明亮度下降。相比而下，采用HPM处理的枣汁，其L*值显著高于其他各组（P＜0.05），表明HPM处理可以较好地保护枣酒的明亮度，这与吴顺红等[29]的研究结果相一致。

红色度（a*）在发酵过程中呈逐渐升高的趋势。其中，对照组的a*由发酵0天时的5.83升至10.67，表明未经杀菌处理的枣酒a*变化较快，枣酒的色泽深，可能是由于酶促反应的原因，使得枣酒发生了褐色物质。采用高压杀菌的枣酒，其a*略低于对照组，高温高压条件使得枣酒的a*值增高，而采用巴氏、NaHSO3和HPM处理的枣酒，在发酵过程中a*没有显著差异（P＞0.05）。

黄色度（b*）在枣酒发酵过程中也呈现逐渐升高的趋势。对照组和HPM组的b*变化不显著，而采用NaHSO3杀菌的枣酒在发酵第6天后，b*值大幅增加。采用高压和巴氏杀菌的在枣酒，b*有明显增加（P＜0.05），表明热杀菌显著提高了枣酒的黄色度。

表2 不同杀菌方式对低醇枣酒色差值的影响Table 2 Effect of different sterilization methods on color difference value of low-alcohol jujube wine

2.3 不同杀菌方式对发酵枣酒营养成分的影响

低醇枣酒中仍含有红枣中的主要营养成分，在经过不同的杀菌处理和发酵之后，枣酒中营养成分变化如表3所示。总体来看，在经过不同的杀菌处理后，枣酒中的总酚含量和多糖含量有所增加，而抗坏血酸和蛋白质含量则有所降低。采用高压杀菌、NaHSO3和HPM这3种杀菌方式，均可以提高总酚含量，是由于这些杀菌方式均可以提高枣酒中酚类物质的溶解量。在发酵的前4d，枣酒中的多酚含量较高，之后随着发酵的进行，多酚类物质含量有所下降。这与李旋等[13]报道的枣酒多酚类物质在发酵后期，有略微下降的结果相一致。

表3 不同杀菌方式对低醇枣酒部分理化指标的影响Table 3 Effect of different sterilization methods on partial physical and chemical indexes of low-alcohol jujube wine

对枣酒中的多糖含量而言，无论是否采取杀菌处理，在发酵第2天，枣酒中的多糖含量都增加了，尤以对照组和高压杀菌组的多糖含量最高，显著高于其他组（P＜0.05）。红枣汁含糖量高，在杀菌后多糖更易溶出，从而含量增加。据吴顺红等[29]报道，采用120 MPa的高压微射流处理红枣汁，可使红枣汁的可溶性固形物含量提高约29.6%，是归因于红枣汁通过高压微射流处理后，强烈的撞击过程中瞬间生成巨大能量，使物料中的糖、维生素及矿物质等大颗粒物质破碎、降解。然而在后期的发酵过程中，多糖含量又有所降低，是因为酵母菌的生长消耗了糖类物质。

抗坏血酸和蛋白质含量在经杀菌和发酵后均有所降低。高压杀菌、巴氏杀菌和NaHSO3都引起了抗坏血酸的损失，而采用HPM杀菌后，枣酒中的抗坏血酸破坏较小。在发酵第8天，HPM组仅损失了7.67%的抗坏血酸，而高压杀菌组则损失了18.71%。相似的，蛋白质含量也表现出相同的趋势。蛋白质含量的降低主要是由于发酵过程中酵母菌消耗蛋白质作为氮源，也有可能是蛋白质与其他物质如单宁等结合生成沉淀[15]。采用HPM杀菌处理，在发酵第8天，枣酒中约90.40%的蛋白质被保留，而高压杀菌的枣酒中则仅保留了43.43%的蛋白质。

2.4 不同杀菌方式对发酵枣酒酒精度的影响

作为低醇果酒，本研究中得到的低醇枣酒的酒精度约为2.00%vol～3.50%vol，要显著低于其他被报道的果酒的酒精度含量[1，6，18]（P＜0.05）。这主要与发酵菌种、接种量和发酵条件有直接的关系。李希[8]采用4种不同的酵母菌发酵桑葚果酒，结果发现，酵母菌Z5发酵的桑椹酒酒精度最低（2.87%vol），而AQ1酵母发酵的桑椹酒酒精度高达7.01%vol。同时，当接种量为3%时AQ1发酵的低醇桑葚酒酒精度显著高于接种1%的样品（P＜0.05）。低醇饮料的功效主要在于乙醇含量低，从而降低了乙醇造成的身体伤害，并且能保持原材料所独有的原始风味，同时也富含多种营养物质[5]。

图2 不同杀菌方式对低醇枣酒酒精度含量的影响Fig.2 Effect of different sterilization methods on alcohol content of low-alcohol jujube wine

由图2可知，酒精度随着发酵时间的延长逐渐增加，对照组和巴氏杀菌组的酒精度增加的较少，可能是由于杀菌不彻底，导致酿酒酵母的发酵进行的不完全。相比较而言，NaHSO3和HPM杀菌处理的枣酒的酒精度含量较高，在发酵第8天时，HPM处理的枣酒酒精度显著高于其他组（P＜0.05）。

2.5 不同杀菌方式对发酵枣酒感官评价的影响

以发酵第8天的枣酒为评价对象，参照表1的评价标准进行感官评价，结果如图3所示。由图3可知，采用HPM杀菌处理的样品感官评分最高（7.62），其次为高压杀菌的枣酒（7.15）。结果表明，采用HPM处理枣汁，后经酵母菌发酵的枣酒感官评价优于巴氏杀菌和NaHSO3处理的样品。

图3 不同杀菌方式对枣酒发酵第8天的感官评价影响Fig.3 Effect of different sterilization methods on sensory evaluation of low-alcohol jujube wine fermented for 8 d

3 结论

采用HPM杀菌处理对枣酒的pH和可滴定酸含量影响较小，对枣酒的明亮度和酒精度有显著的提升效果，并且获得了较高的感官评分。

枣酒发酵前的杀菌处理增加了枣酒中的总酚和多糖含量，却降低了抗坏血酸和蛋白质含量。与其他杀菌方式相比，采用HPM杀菌处理对抗坏血酸的损失最小。

HPM作为一种新型的高压处理技术，目前在液态食品中的应用还较少，尤其是用于杀菌处理方面的研究甚少。本研究发现，采用HPM处理能有效保持枣酒的营养成分，有望成为一种新的杀菌处理方式。