七叶莲种子质量检验方法研究

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(1.四川中医药高等专科学校药学院，四川 绵阳 621000；2.云南省药物研究所，昆明 650111)

七叶莲(Scheffleravenulosa)为五加科(Araliaceae)鹅掌柴属(Schefflera)植物密脉鹅掌柴。七叶莲具有止痛散瘀，活血消肿，舒经活络的功效，收载于2005版《云南省中药材标准》[1]，为痛舒胶囊、肿痛气雾剂、七叶莲片及复方风湿宁片等中成药的主要原料。近年来，随着七叶莲药效的不断发掘，七叶莲需求量逐年增加，而目前七叶莲药材基本来源于野生资源，为保障市场需求及保护野生资源，迫切需要开展七叶莲栽培研究。种子检验可评价和控制种子质量，是保证种子质量的关键措施[2-3]，为保障七叶莲种子质量，亟需研究其种子质量检验方法。本研究以七叶莲种子为试验材料，依据我国农作物种子检验规程的方法[4]，开展七叶莲种子质量检验方法研究，以期为七叶莲种子质量标准建立提供依据和支持。

1 材 料

2016年6月，七叶莲种子采自普洱市思茅区六顺镇、普洱市孟连县富岩乡、普洱市思茅区倚象镇、普洱市宁洱县宁洱镇、玉溪市元江县因远镇5个居群。经中国科学院昆明植物研究所研究员李恒鉴定为五加科鹅掌柴属植物七叶莲(Scheffleravenulosa)。

2 方 法

2.1 扦 样

七叶莲种子扦样依据《农作物种子检验规程》规定进行[3-4]。

2.2 净度分析

七叶莲种子净度分析依据《农作物种子检验规程》规定进行[3-4]。

2.3 种子真实性鉴定

体视显微镜下观察种子形态特征，并用数显卡尺测量其长宽度[3]。试验重复3次，每次100粒种子。

2.4 种子水分测定

七叶莲种子水分测定采用低恒温(105 ℃)烘干法和高温(130 ℃)烘干法进行，准确称取每份种子样品2 g，要求每份样品2次测定值差距不超过0.2%，试验2次重复[3-5]。

2.5 种子重量测定

采用百粒法和千粒法进行[3-5]。

2.6 种子生活力测定

2.6.1 染色温度和时间

将七叶莲种子于蒸馏水中浸泡24 h，纵切，留一半备用。用0.05%TTC溶液浸没纵切后的种子，分别置于20，25 ℃和30 ℃ 的恒温光照培养箱中，避光条件下染色4，8，16，24 h和48 h后进行观察并统计染色情况，试验3次重复，每重复100粒种子[4,6]。

2.6.2 TTC浓度确定

将七叶莲纵切后的种子完全浸没于0.01%，0.05%和0.1%TTC溶液中避光染色，观察并统计染色情况，试验3次重复，每重复100粒种子[4,6]。

2.7 种子发芽率测定

2.7.1 发芽温度确定

将种子置于2层滤纸培养皿中，分别于15，20 ℃和25 ℃恒温光照培养箱中发芽，试验3次重复，每重复100粒种子[4,7]。

2.7.2 光照时间确定

将种子置于铺有2层滤纸培养皿中，在25 ℃下光照0 h和25 ℃下光照12 h的恒温培养箱中发芽，试验设3次重复，每重复100粒种子[4,7]。

2.7.3 发芽床选择

选取纸上、砂上、砂中3种发芽床。将种子分别置于不同发芽床上，在25 ℃恒温光照培养箱中发芽，试验设3次重复，每重复100粒种子[4,7]。

3 结果与分析

3.1 扦 样

七叶莲种子扦样采用分样器进行，种子批的最大总重量为5 000 g，种子送检样品不少于500 g，种子净度分析试样不少于50 g。

3.2 种子真实性鉴定

七叶莲种子形状为肾形，灰白色，表面粗糙。种子长度为3.2～5.0 mm，宽度为1.6～2.8 mm。

3.3 种子净度分析

七叶莲种子净度分析结果见表1。七叶莲种子杂质主要为果梗和果皮，无其它植物种子。5个产地七叶莲种子净度均在82.0%以上，各产地试样增失差距均没有偏离分取样品质量的5.0%，因此该方法和程序适宜用于七叶莲种子净度分析。

表1 不同产地七叶莲种子净度分析

样本号采集地点分取样品质量(g)净种子质量(g)杂质质量(g)增失(%)净度(%)1普洱市思茅区六顺镇50.1348.211.850.1496.172普洱孟连县富岩乡49.9247.902.000.0495.953普洱市思茅区倚象镇50.0847.013.030.0893.874普洱市宁洱县宁洱镇50.1541.158.970.0682.055玉溪市元江县因远镇50.2147.252.860.2094.10

3.4 种子水分测定

采用低恒温(105 ℃)和高恒温(130 ℃)烘干法测定5个产地七叶莲种子水分结果如图1和图2所示。采用低恒温烘干法，七叶莲种子在60 min内失水迅速，之后种子失水变缓，种子水分在70 min后保持稳定，因此，低恒温烘干法测定七叶莲种子水分适宜烘干时间为70 min。采用高恒温烘干法，七叶莲种子在25 min内失水迅速，之后种子失水减缓，种子水分在30 min后保持稳定，因此，高恒温烘干法测定七叶莲种子水分适宜烘干时间为30 min。比较高恒温烘干法和低恒温烘干法测定的种子水分结果可知，高恒温烘干法测定的种子水分高于低恒温烘干法，且烘干时间短。因此，七叶莲种子水分测定适宜方法为高恒温烘干法，烘干时间为30 min。

图1 低恒温(105 ℃)烘干法测定种子水分

图2 高恒温(130 ℃)烘干法测定种子水分

采用高恒温烘干法(130 ℃)对5个产地七叶莲种子水分测定可知(图2)，七叶莲种子水分为10.3% ～10.8%。

3.5 种子重量测定

采用百粒法和千粒法分别测定5个产地七叶莲种子千粒重，测定结果见表 2。采用百粒法测定七叶莲种子千粒重时，样本2和样本4变异系数均大于4.0%，表明测定值无效，故七叶莲种子千粒重测定不宜采用百粒法进行测定。应用千粒法测定时，2次测得的差数和平均数之比均小于5.0%，表明测定值有效。因此，七叶莲种子重量测定适宜的方法为千粒法，千粒重为1.2～1.8 g(表2)。

3.6 种子生活力测定

3.6.1 染色温度和时间

七叶莲种子生活力测定受TTC染色温度和时间的影响(表3)。有生活力的七叶莲种胚被 TTC 染为鲜红色，染色均匀，胚乳完全着鲜红色或浅红色。采用0.05%TTC在20，25 ℃和30 ℃的恒温光照培养箱中，避光条件下染色16，24，48，52 h后结果如表3所示。随着温度升高，测定的七叶莲种子生活力值增加，但均在染色48 h后趋于稳定，表明染色适宜时间为48 h。同时25 ℃和30 ℃下染色48 h的七叶莲种子生活力差异不显著，表明染色适宜温度为25 ℃，在此条件下测定的七叶莲种子生活力为82.7%。

表2 不同产地七叶莲种子重量测定

样本号 百粒法 千粒法 千粒重(g)标准差变异系数(%)千粒重(g)重复间差数(g)差数/平均数11.22810.00181.501.23220.00730.5921.60070.00684.221.61290.01580.9831.27360.00221.701.26600.00920.7341.19560.00282.361.16260.01631.4051.80050.01194.251.76250.03761.36

表3 染色温度和时间与种子生活力测定的关系

染色温度(℃)染色时间(h)162448522020.7c43.0c62.3b63.0b2532.3b56.3b82.7a83.3a3047.7a66.7a85.0a86.3a

注：表格中不同字母表示差异显著[8]。本试验所用种子为5个产地种子混合样品。

3.6.2 TTC浓度确定

七叶莲种子生活力测定值随着TTC浓度的增加先升高后降低，但均在TTC浓度为0.05%时达到最大值(表4)，分别为83.9%、81.0%、94.1%、90.0%和86.7%，表明七叶莲种子生活力测定宜采用浓度为0.05%TTC进行。

表4 TTC浓度与七叶莲种子生活力测定的关系

TTC浓度(%)样本号123450.0173.3b72.7b86.0b80.7b74.3b0.0583.9a81.0a94.1a90.0a86.7a0.174.7b75.3b92.3a88.7a86.0a

3.7 种子发芽率测定

3.7.1 发芽温度确定

七叶莲种子发芽率随着温度的升高而增加(表5)。5个产地七叶莲种子发芽率均在25 ℃时最高，表明25 ℃为七叶莲种子发芽的适宜温度。25 ℃下七叶莲种子发芽率分别为68.7%、67.3%、85.0%、76.7%和74.3%，显著高于20 ℃和15 ℃下七叶莲种子发芽率(p<0.05)。

3.7.2 光照时间确定

光照时间对七叶莲种子发芽的影响如表6所示，5个产地七叶莲种子在光照0 h和光照12 h下发芽率均无显著差异(p>0.05)。因此，光照时间对七叶莲种子发芽无显著影响。

表5 温度与七叶莲种子发芽的关系

发芽温度(℃)样本号123451547.0c44.7c61.3c50.7c51.3c2058.3b60.7b74.0b69.7b63.0b2568.7a67.3a85.0a76.7a74.3a

表6 光照时间与七叶莲种子发芽的关系

光照时间(h)样本号12345069.3a65.0a82.3a80.0a72.7a1268.7a67.3a85.0a76.7a74.3a

3.7.3 发芽床确定

发芽床对七叶莲种子发芽的影响如表7所示，5个产地七叶莲种子分别在纸上、砂上和砂中3种发芽床下发芽率无显著差异。鉴于发芽床对七叶莲种子发芽无显著影响，而从操作方便性上考虑，适宜选择纸上发芽床进行测定。

表7 发芽床与七叶莲种子发芽的关系

发芽床样本号12345纸上68.7a67.3a85.0a76.7a74.3a砂上65.3a69.0a84.3a79.0a70.7a砂中67.0a65.0a87.7a74.7a75.0a

4 结论与讨论

目前，我国仅有少量中药材种子有相应的种子检验方法，如川牛膝、三七、甘草、丹参、白花蛇舌草等，绝大部分中药材种子仍缺乏种子质量检验方法，无法评价和控制其种子质量[9-13]。随着对七叶莲开发应用的不断研究，其市场需求量显著增加，当前已逐渐开始人工栽培种植，但当前七叶莲种子尚未有相应的种子质量检验的方法，以致生产的七叶莲种子质量参差不齐，显著影响其药材质量。

本研究通过测定不同产地七叶莲种子质量，明确了七叶莲种子质量检验适宜的方法。具体方法为：种子净度分析试样应不少于50 g；种子真实性鉴定宜采用体视显微镜观察；水分测定宜采用高恒温(130 ℃)烘干法，烘30 min；重量测定宜采用千粒法；生活力测定宜采用0.05%TTC，25 ℃下避光染色48 h；发芽率测定宜采用纸上发芽床，发芽温度为25 ℃。不同产地气候自然环境存在一定区别，对种子发育及生物学特性均会产生影响，因此，对中药材种子质量检验方法研究时应重视试验材料的可代表性[14-15]。研究所用七叶莲种子采于5个七叶莲主产区，具有较好的代表性，可有效避免产地不同导致的生物学特性差异对七叶莲种子质量检验方法造成的影响。本研究通过对5个产地七叶莲种子质量的测定，明确了七叶莲种子质量检验的方法，可为建立七叶莲种子质量标准提供依据和支持。