吡虫啉种衣剂对小麦幼苗氮代谢的影响及机制研究

，，，

(河南农业大学植物保护学院，郑州 450002)

小麦苗期病虫害是影响小麦产量的主要因素。随着种衣剂的推广和应用，通过种衣剂处理小麦种子来预防小麦苗期病虫害逐渐成为一种重要的农业措施。研究表明，种衣剂可以提高小麦抗氧化酶活性、促进小麦植株生长、提高小麦对逆境和病虫害的抗性[1-2]，从而达到小麦的高产和稳产。但是，种衣剂对植物产生的负面影响也有报道，例如烯唑醇种衣剂包衣对小麦的出苗时间和出苗率具有抑制作用[3]；戊唑醇悬浮种衣剂对小麦种子萌发的影响主要表现在推迟出苗时间和增加畸形植株数量[4]；三唑类杀菌剂易引起小麦和玉米不同程度的药害，影响作物幼苗出土、抑制幼苗生长[5]等。

以吡虫啉(Imidacloprid)为原药的种衣剂可以由植物根系吸收，持效期长，能有效防治水稻、小麦、甜菜等作物苗期害虫，尤其对刺吸式口器害虫有特效[6]。前期的研究发现，吡虫啉种衣剂会推迟小麦出苗时间，而这种作用产生的原因可能是吡虫啉种衣剂影响种子吸水性和萌发相关酶活性从而推迟小麦种子萌发[7]。植物体内的氮化物包括蛋白质、氨基酸等，主要用于组成原生质，促进植物生长。在生长初期，植物吸收氮的能力强，以氮素代谢为主，此时正是器官建成时期，需要大量的氮素供应，以防止后期早衰。因此在植物生长初期，氮素代谢对植物生长发育起着重要的作用。关于吡虫啉种衣剂对植物氮代谢的影响以及这些影响产生的机理目前仍不清楚。本研究在前期研究的基础上，通过分析吡虫啉种衣剂对小麦萌发和幼苗生长阶段氮代谢途径关键酶活性以及酶编码基因表达和代谢产物的影响，研究种衣剂对小麦初生代谢的影响，为种衣剂的安全使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究材料

矮抗58小麦，购自河南秋实种业科技股份有限公司；600 g/L 吡虫啉悬浮种衣剂，江苏龙灯化学有限公司产品，购自郑州市农药市场。

1.2 研究方法

1.2.1 拌种处理

吡虫啉悬浮种衣剂分别设置6.67，13.34 g/kg制剂种子2个浓度梯度(下文中分别以吡虫啉1.0×和吡虫啉2.0×表示)，分别取6.67 g和13.34 g吡虫啉种衣剂，加适量清水稀释后对1 kg矮抗58小麦种子进行拌种，清水拌种作为空白对照[7]。为了防止种衣剂脱落，种衣剂拌种后的种子在阴凉处晾干后再进行萌发实验[8]。

1.2.2 萌发试验

选取不同浓度吡虫啉包衣小麦种子各25粒置于垫有3层滤纸的加水培养皿中，每处理各3个重复，每个重复含3个培养皿。将培养皿置于培养箱中[(20±1)℃，每日光照16 h，黑暗8 h]培养发芽，每天在同一时间补充相同量的水分，分别在种子萌发第3、6、9、12、15天时随机取样，样品保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 氮代谢相关酶基因表达量测定

根据NCBI已公布的基因序列，设计用于PCR反应的小麦氮代谢相关酶基因引物序列(表1)。采用Trizol法提取样品RNA，紫外分光光度计测量OD值后，用两步法反转录得到模板cDNA，梯度PCR测定引物的最适退火温度，再以Actin为目的基因，SYBR®green I 为荧光染料进行实时荧光定量PCR，总体系12μL(SYBR®green I 6μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、稀释5倍的模板cDNA 1μL和双蒸水4μL)，2-ΔΔC(t)法计算结果。

表1 氮代谢相关酶基因的引物

基因酶参考序列引物序列NR硝酸还原酶X57844.1F:gctgatgcaccacggcttcaR:gggaaaccgttggcaagctcNiR亚硝酸还原酶FJ527909F:attattcgccgtcgtcgtcR:atatgccgccctccgtgaagGS谷氨酰胺合成酶JF894116.1F:gcccttcaccgacaagatcaR:atggcctgtgggtatagaaGOGAT谷氨酸合成酶KF521800F:cgacatcttagcagaacgtggagR:ccatcaccggagtcgttgGDH谷氨酸脱氢酶HQ821868F:gagtgcacaattccgaaagR:gaatattggccacggctgACTINAB181991.1F:tggcatcacacgttctacaacR:gcctggattgcgacata

1.2.4 氮代谢相关酶活性测定

1) 硝酸还原酶(Nitrate reductase，NR)活性测定：参考高俊凤[9]的方法。样品加入提取缓冲液及少量石英砂冰浴中研磨匀浆，4 ℃、4 000 r/min离心15 min，所得上清液即为粗酶提取液。取粗酶液0.2 mL，加入0.3 mL 2 mg/mL NADH溶液和0.5 mL 0.1 mol/L KNO3溶液混匀， 25 ℃保温30 min，以1 mL 30%三氯乙酸作为对照。保温结束后加入1 mL 30%三氯乙酸摇匀以终止反应，加入2 mL 0.2% a-萘胺溶液，2 mL 1%磺胺溶液，摇匀静置显色15 min，测定反应液在520 nm的吸光度。根据回归方程计算反应液中所产生的亚硝态氮总量[10]。

2) 亚硝酸还原酶(Nitrite reductase，NiR)活性测定：参考Scheible W R等[11]的方法。反应液(1.35 mL)包括：0.05 mL 10 mmol的亚硝酸钠溶液、1 mL pH=7.5的100 mmol磷酸钠缓冲液、0.05 mL甲基紫精溶液、蒸馏水0.05 mL，最后加酶提取物0.15 mL。反应液中加入0.05 mL连二亚硫酸钠盐(50 mg/mL)后在25 ℃下反应30 min。取0.2 mL反应液加蒸馏水稀释至6.7 mL，加入1%(w/v)盐酸萘乙二胺1.5 mL和1.8 mL 1%磺胺。15 min后，测定反应液在540 nm处吸光率。

3) 谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)活性测定：提取缓冲液：0.05 mol/L Tris-HCl，pH=8.0，含2 mmol/L DTT、2 mmol/L MgSO4、0.4 mol/L蔗糖；反应混合液A：0.1 mol/L pH=7.4 Tris-HCl缓冲液，含20 mmol/L谷氨酸钠盐，80 mmol/L Mg2+，20 mmol/L半胱氨酸和2 mmol/L EGTA；反应混合液B(含盐酸羟胺，pH=7.4)：反应混合液A再加入80 mmol/L盐酸羟胺；显色剂：0.2 mol/L TCA，0.37 mol/L FeCl3和0.6 mol/L HCl的混合液；40 mmol/L ATP溶液(临用前配制)。样品冰浴中加入提取缓冲液研磨匀浆，4 ℃，15 000 g离心20 min，所得上清液为粗酶液。取0.7 mL粗酶液加入1.6 mL反应混合液B和0.7 mL ATP溶液混匀，并置于37 ℃下保温。30 min后加入1 mL显色剂摇匀，5 000 g下离心10 min，取上清液测定其在540 nm处的吸光值。以加入1.6 mL反应混合液A的溶液作为对照[12]。

4) 谷氨酸合成酶(Glutamate synthase，GOGAT)活性测定：提取液配制以及粗酶液提取方法采用上述GS酶活性测定中的方法进行。反应混合液含0.4 mL 20 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mL 10 mmol/L的KCl、0.5 mL 20 mmol/L a-酮戊二酸、0.2 mL 3 mmol/L NADH和0.3 mL粗酶液，用25 mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH=7.6)补足1.5 mL。于340 nm处每隔30 s测定反应液消光值，取光密度稳定减小的一段来衡量酶活性[13]。

5) 谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase，GDH)活性测定：提取液为0.2 mmol/L Tris-HCl(pH=8.2)；反应液A：1.6μmol/L NAD+360μmol/L Tris-HCl(pH=9.0)；反应液B：1.6μmol/L NAD+60μmol/L L-谷氨酸+360μmol/L Tris-HCl(pH=9.0)。植物材料冰浴中加入提取液研磨匀浆，取1 mL酶提取液加入2 mL反应液B，以反应液A为对照，反应溶液在340 nm处比色，每隔30 s记录一次消光值，直至读数稳定[14]。

1.2.5 氮代谢物质含量测定

可溶性蛋白质含量测定：采用考马斯亮蓝法[15]；游离氨基酸总量测定：采用茚三酮显色法[16]。

1.2.6 数据分析和处理方法

实验数据通过Excel 2010软件进行处理，用SPSS 19.0软件方差分析和相关性分析(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 种衣剂对氮代谢酶编码基因表达的影响

选择植物氮代谢途径中的关键酶：硝酸还原酶(NR)、亚硝酸还原酶(NiR)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脱氢酶(GDH)为研究对象，首先利用荧光定量PCR法分析种衣剂处理后氮代谢途径关键酶编码基因的表达变化，研究种衣剂对氮代谢途径酶编码基因表达的影响。结果(图1)显示：高浓度的吡虫啉处理后小麦植株中氮代谢途径相关基因表达量均显著下降；而低浓度的吡虫啉处理后NR基因表达量除了小麦萌发第9天明显提高，其余时期降低。结果说明吡虫啉种衣剂会降低氮代谢途径关键酶的基因的表达量，而且这种抑制作用和种衣剂的使用浓度呈现正相关关系。

注：“*”和“**”分别表示差异显著(p<0.05)和极显著(p<0.01)。下同。图1 吡虫啉对小麦氮代谢基因表达量的影响

图2 吡虫啉对小麦氮代谢关键酶活性的影响

图3 吡虫啉包衣对小麦氮代谢产物含量的影响

2.2 种衣剂对氮代谢酶活性的影响

在确定吡虫啉种衣剂影响植株氮代谢基因表达的基础上，采用生理生化方法测定了硝酸还原酶(NR)、亚硝酸还原酶(NiR)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脱氢酶(GDH)活性。结果(图2)显示：低浓度吡虫啉种衣剂处理后NR和GS酶活性增加，而NiR、GOGAT和GDH酶活性降低，高剂量吡虫啉种衣剂处理后NR、NiR和GDH酶活性降低；而GS和GOGAT酶活性反而增加。从结果看出，不同浓度种衣剂对氮代谢酶活性的影响不同，不同酶活性对种衣剂的相应也不相同。

2.3 种衣剂对氮代谢产物的影响

为了揭示种衣剂对氮代谢水平的影响，分析了种衣剂对植物氮代谢产物：游离氨基酸含量和可溶性蛋白质含量的影响。从图3可看出，吡虫啉种衣剂处理后小麦植株中可溶性蛋白质和游离氨基酸含量显著增加，而且随着与种衣剂的使用浓度呈正相关关系。

3 结论与讨论

氮代谢是植物生命活动中最基本的代谢体系之一，主要作用包括无机氮的同化、还原以及含氮有机化合物的合成、转化等。植物生长初期，正是器官建成时期，吸收氮的能力强，以氮素代谢为主。因此研究种衣剂对植物幼苗生长时期氮代谢的影响可以揭示种衣剂对植物生长发育影响的生理基础，具有重要的意义。前期研究发现，吡虫啉种衣剂可推迟小麦种子萌发，影响小麦幼苗生长[7]。因此，本研究拟研究吡虫啉种衣剂对小麦氮代谢的影响，揭示吡虫啉种衣剂对小麦影响产生的生理机制。

植物体内NR和NiR分别催化NO3-还原为NO2-和NO2-还原为NH4+，最终NH4+参与到蛋白质的合成。NR和NiR酶是氮代谢的关键酶，其活性的调控在氮同化控制中起着重要作用，并显著影响植物生长发育[17]。本研究发现，吡虫啉种衣剂处理后，小麦植株中亚NiR基因表达和酶活性均显著下降。谷氨酰胺合成酶(GS)是氮代谢过程中的关键酶，能催化NH4+和谷氨酸合成谷氨酰胺，是高等植物氮素同化的主要途径[18]，过量的NH4+对植物机体有毒害作用，而GS活性增强可以促进铵态氮与谷氨酸合成谷氨酰胺，进一步合成谷氨酸，使NH4+同化加强，是植物的一种自我保护机制[19-20]。结果显示，处理后GS基因表达下降，但是催化活性却显著增加，可能是在种衣剂处理下，需要加速氮代谢，从而加强植物的自我保护。同时，GDH活性呈增加趋势，可以促进NH4与a-酮戊二酸转化成谷氨酸，有助于氮代谢的进行[21]。本研究发现，种衣剂处理后，植株中GDH基因表达量和酶活性均显著降低。

游离氨基酸在植物细胞中以游离态存在，可被合成氨基酸和蛋白质，是植物氮运输的主要形式[22]。用游离氨基酸含量可部分反映氮转化的生理变化，游离氨基酸含量减少，可促使氮的转化向蛋白质合成的方向发展[19]。可溶性蛋白是小麦氮同化物累积的主要形式和最终产物，因此在同化物代谢的过程中起着重要作用[23]。本研究发现，吡虫啉种衣剂处理后，小麦植株中游离氨基酸和可溶性蛋白质含量均显著增加，而且呈现出浓度效应。说明吡虫啉种衣剂处理后，小麦植株中氮代谢加快，氮素消耗加速，如果不及时补充氮源，则会影响小麦的生长和发育。