黑青稞根际促生菌筛选及其对种子萌发的影响

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(1.西藏农牧学院植物科学学院, 西藏 林芝 860000； 2.西藏农牧学院食品科学学院, 西藏 林芝 860000)

青稞起源于西藏，是藏族人民的主粮[1]。黑青稞含有多种有益人体健康的矿物质如铜、锌、铁等，同时具有高维生素、高膳食纤维、高蛋白质、高β-葡聚糖等特点，含有独特的花青素类物质，且原花青素和总黄酮含量较高，具有防癌、抗癌作用的微量元素硒，符合现代人所青睐的黑色健康食品的需求，同时作为西藏重要的特色资源而倍受关注[2-4]。西藏有特殊的地理位置、气候类型和地质历史以及耕作习惯，从而造就了其独特的土壤特征：N素少(全N 0.2～2 g/kg，速效N 20～80 mg/kg)，P 素缺(全P 0.22～1.42 g/kg，速效P 1～133 mg/kg)，K 素和微量元素比较丰富。这种土壤状况制约了青稞的产量及质量的提高[5-6]。虽然化学肥料的使用可以在一定程度上解决这一问题，却使得生产成本增加、环境恶化。

植物根际促进菌(plant growth promoting rhizobacteria ，PGPR)可视为有益微生物，其生物种类多元，如固氮菌可减少氮肥的使用，可将空气中的氮以nitrogenase催化铵态氮源，减少对氮肥的依赖。磷肥在使用后会流失在土壤中，大部分的磷元素与土壤中的钙、镁、铝、铁结合后呈现不溶形态的复合物，而PGPR中有许多物种可产生有机酸或离子嵌合剂，将土壤中存在的磷酸铝、磷酸胺镁、磷酸钙及磷酸铁等磷酸复合体溶解，经由微生物转化为有机磷，提供植物营养[7]。这些PGPR微生物常由健康植株中的土壤环境所筛选，并以其为原料研制而成的微生物肥料制剂在农业中也被广泛应用。研究结果表明，施用微生物肥料不仅可以提高作用对象的产量和品质，而且还具有促进种子的萌发、提高发芽率和苗期成活率的作用[7-11]。

本试验通过分离纯化隆子县黑青稞根际促生菌，筛选其中具有固氮、溶磷能力的菌株，发掘潜在的微生物资源，以减少青稞生产对化学肥料的依赖，为青稞可持续发展提供参考。

1 材 料

1.1 供试土壤及青稞

土壤样品采自西藏山南隆子县青稞田，取0～20 cm土层的根系( 带土) 样品，保存于无菌纸袋中带回实验室。供试青稞种子为西藏山南隆子县黑青稞。

1.2 培养基及试剂

Ashby培养基： KH2PO40.2 g，CaCO35.0 g， MgSO4·7 H2O 0.2 g， Mannitol 10.0 g，NaCl 0.2 g，Agar 15 g，CaSO4·2 H2O 0.1 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0～7.5[12]。

LB培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0～ 7.2[12-13]。

无机磷培养基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7 H2O 0.3 g，FeSO4·7 H2O 0.03 g，MnSO4·4 H2O 0.03 g，Ca3(PO4)25.0 g 蒸馏水1 000 mL，pH=7.0～ 7.2[14]。

蒙金娜培养基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7 H2O 0.3 g，FeSO4·7 H2O 0.03 g，MnSO4·4 H2O 0.03 g，卵磷脂0.2 g，CaCO35.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0～ 7.5[14]。

以上培养基配制时均用蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃灭菌30 min，需要用固体培养基时，在此配方基础上加20 g琼脂。

2 方 法

2.1 黑青稞根际土壤悬液的制备

抖落黑青稞根系上较大的土壤颗粒，把根系剪切成3 cm左右的根段并混合，然后称取10 g置于含有90 mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，即为黑青稞根际土壤悬液，将土壤悬液10 倍梯度稀释，制成10-7～10-1土壤稀释液[12]。

2.2 黑青稞根际促生菌初筛

分别取10-7～10-3土壤稀释液1 mL于灭菌后的培养皿中，分别倾注Ashby培养基、无机磷培养基和蒙金娜有机磷培养基，置于28 ℃培养箱培养5～7 d，选取透明圈较大的单菌落进行复筛[12]。

2.3 黑青稞根际促生菌复筛

2.3.1 解磷能力

将初筛菌株接种于LB培养基中培养至对数期，按照1%的接种量分别接种到液体无机磷培养基、蒙金娜有机磷培养基中，于28 ℃、160 r/min振荡培养7 d，4 ℃、18 000 r/min 离心5 min，采用钼锑抗比色法测定有效磷含量[15]。

2.3.2 固氮量

将初筛菌株接种于LB培养基中培养至对数期，按照1%的接种量分别接种到液体Ashby培养基中，于28 ℃、160 r/min振荡培养7 d，采用半微量凯氏定氮法测定含氮量[16]。

2.4 黑青稞根际促生菌菌株对黑青稞种子萌发的影响

将筛选的溶磷、固氮菌的菌株分别接种到蒙金娜液体培养基、无机磷液体培养基和Ashby液体培养基中，30 ℃、160 r/min振荡培养至对数后期或稳定期，用无菌水稀释至菌液浓度约为108cfu/mL，备用[17]。

表1 黑青稞PGPR固氮及有效磷含量测定结果

固氮菌氨氮(N,mg/L)解无机磷菌株有效磷含量(mg/L)解有机磷菌株有效磷含量(mg/L)HQ3-2124.31±0.72aSR9-456.37±1.49eSR6-183.87±2.22eHQ3-3116.02±1.33cSR10-651.88±1.37fSR6-2162.00±2.31bHQ3-5120.82±2.14bSR15-171.63±2.15dSR7-377.13±2.32fHQ6-3101.15±1.54fSQ15-275.75±0.76cSR10-675.75±0.76fHQ7-2105.3±1.59eLQ14-292.13±1.6bSR11-279.50±1.38efHQ7-4112.20±1.91dHQ9-151.38±0.52fSR11-380.00±0.8efN59104.30±0.60eHQ36-158.75±1.18eSR17-283.88±2.12eN63101.85±1.02fHQ36-2122.37±2.34aSR19-192.13±0.93dN72105.34±0.61eSR20-2251.38±2.43aSR22-375.75±2.27fLQ3-3129.00±2.41cLQ14-276.62±2.03f

注：同列不同小写字母分别表示处理间在0.05水平有显著差异。下同。

选取饱满、均匀一致的黑青稞种子50粒，移至75%乙醇中处理30 s，无菌水清洗4～5次后，再用7%的 NaClO溶液浸泡1 min，无菌水清洗4～5次，进行种子表面消毒。将消毒的黑青稞种子分别浸入菌液中，25 ℃ 吸附1 h，于无菌操作台上风干后，转置于垫有润湿滤纸的无菌培养皿内，25 ℃黑暗培养7 d。以浸泡无菌水的黑青稞种子做阴性对照，以不接菌的培养液做阳性对照。培养结束后，测量各幼苗茎长、根长，计数侧根数[17]。

计算各项发芽指标：发芽势(%)=(前3 d发芽种子数/种子总数)×100%；发芽率(%)=(7 d发芽种子数/种子总数)×100%；发芽指数(GI)=Gt/Dt。

式中：Gt为在t天内的发芽数，Dt为相应的发芽时间[17]。

2.5 数据处理

采用 Excel 2016软件和SPSS 19.0软件进行统计分析。

3 结果与分析

3.1 黑青稞根际促生菌的初筛及复筛结果

采用倾注培养基法，28 ℃培养，初步筛选出固氮细菌20株、解无机磷细菌28株、解有机磷细菌30株，经多次传代，最终选取长势较好、溶磷圈较大的固氮细菌9株、解无机磷细菌12株、解有机磷细菌8株进行复筛。

采用半微量凯氏定氮法定量测定9株固氮菌有效氮含量，结果如表1。由表1可知，菌株HQ 3-2、HQ 3-3、HQ 3-5和HQ 7-4固氮量较高，有效氮含量均达110 mg/L以上。采用钼锑抗比色法定量测定无机磷细菌和有机磷细菌的有效磷含量(表1)，结果表明，溶解有机磷菌株SR 20-2、SR 6-2、LQ 3-3和SR 19-1产有效磷较高，均达到92 mg/L以上，其中菌株SR 20-2产磷最高，有效磷含量达251.38 mg/L。8株解无机磷细菌中有效磷含量最高的为菌株HQ 36-2，达122.37 mg/L，其次为菌株LQ 14-2，达92.13 mg/L，再次是菌株SR 15-2和SR 15-1，有效磷含量达71 mg/L以上；有效磷含量最差的是菌株SR 10-6、HQ 9-1和HQ 36-1。

3.2 黑青稞根际促生菌菌株对黑青稞种子萌发的影响

3.2.1 PGPR对黑青稞种子萌发的影响

分别选取优良固氮菌、无机磷溶解菌、有机磷溶解菌各4株进行黑青稞种子萌发实验(表2)。由表2可知，除菌株HQ 3-2对青稞种子发芽具有抑制作用外，其余菌株对黑青稞种子发芽均有一定的促进作用。其中菌株HQ 3-3、HQ 7-4、SR 15-2、HQ 36-2和SR 6-2处理对黑青稞种子的萌发率效果较好，发芽率分别达到97.50%、92.50%、92.50%、91.67%和90.00%，与ck相比，发芽率分别增长了36.05%、29.07%、29.07%、27.91%和25.58%(表3)。

表2 黑青稞PGPR浸种对种子萌发的影响

菌株发芽率(%)发芽势(%)发芽指数HQ3-222.5±2.50i14.17±2.89f3.75±0.65iHQ3-397.50±2.10a83.83±1.26a21.74±0.57aHQ3-585.00±2.80de71.50±1.32cd18.61±0.58cdHQ7-492.50±4.30b80.83±3.82a20.52±1.08bSR15-184.17±1.40de71.50±1.30cd18.44±0.36cdSQ15-292.50±2.30b80.17±2.25a20.52±0.63bLQ14-286.67±2.89cd73.17±1.61bc19.07±0.72cHQ36-291.67±1.44b78.50±1.23ab20.31±0.36bSR6-290.00±1.67bc71.67±1.41cd17.15±0.43efSR19-178.33±2.89fg73.33±2.21bc16.95±0.32efSR20-273.33±2.25h63.33±1.35e16.39±0.60fgLQ3-381.67±2.43ef66.67±1.89de17.85±0.12deck71.67±5.77h63.33±1.27e13.25±1.16hck172.50±2.50h62.50±1.50e15.98±0.50gck275.00±2.10gh71.67±1.44cd18.24±0.44cdck374.17±1.40gh64.17±1.80e16.68±0.54fg

注：ck为无菌水处理，ck 1为无机磷液体培养基处理，ck 2 为Ashby液体培养基处理，ck 3为蒙金娜液体培养基处理。下同。

由表2可知：菌株HQ 3-3、HQ 7-4、SR 15-2和HQ 36-2的发芽势在75%以上，表3中菌株HQ 3-3、HQ 7-4、SR 15-2和HQ 36-2的发芽势与ck相比，分别增长了32.37%、27.63%、26.58%和23.95%。同时菌株HQ 3-3、HQ 7-4、SR 15-2和HQ 36-2发芽指数在20以上，与ck对比提高了青稞种子的活力；不接菌的培养液对黑青稞种子萌发也有促进作用但效果不明显。

图1 HQ 3-5菌液处理与ck对比

表3 不同菌株菌液处理下发芽率、发芽势及发芽指数变化量

菌株发芽率变化量(%)发芽势变化量(%)发芽指数变化量HQ3-2-68.60-77.63-71.69HQ3-336.0532.3764.09HQ3-518.6012.8940.51HQ7-429.0727.6354.93SR15-117.4412.8939.20SQ15-229.0726.5854.93LQ14-220.9315.5343.94HQ36-227.9123.9553.35SR6-225.5813.1629.49SR19-19.3015.7927.91SR20-22.33023.70LQ3-313.955.2634.75

注：与ck对比的变化量。

3.2.2 PGPR对黑青稞幼苗的促生作用

表4 PGPR浸种对黑青稞幼苗生长的影响

菌株茎粗(mm)芽长(cm)根长(cm)须根数(个)HQ3-21.82±0.05cd7.37±0.19h3.27±0.09g5.6±0.15abHQ3-31.49±0.04h8.52±0.23f4.33±0.12d5.5±0.14bcHQ3-51.63±0.05f11.91±0.36c6.91±0.21a5.4±0.16cdHQ7-41.84±0.02c12.28±0.12b6.8±0.07a5.5±0.06bcSR15-11.56±0.04g4.10±0.11j1.77±0.05j5.6±0.15abSQ15-21.71±0.06e7.79±0.24g3.38±0.11g5.1±0.13fgLQ14-21.74±0.02e9.36±0.1e3.86±0.04e5.5±0.05bcHQ36-21.71±0.04e11.07±0.22d5.02±0.1b5.7±0.11aSR6-22.04±0.03a11.79±0.21c4.95±0.09b5.6±0.1abSR19-11.92±0.02b12.56±0.13b4.52±0.05c5.3±0.07deSR20-21.91±0.06b11.73±0.35c4.25±0.13d5.2±0.16efLQ3-31.77±0.03de13.67±0.24a3.88±0.07e4.7±0.08hck1.58±0.02fg9.66±0.1e3.65±0.04f5.3±0.09deck11.53±0.02gh7.85±0.21g3.81±0.1ef5.0±0.13gck21.39±0.04i5.18±0.13i2.05±0.06i3.9±0.11jck31.56±0.04g5.06±0.14i2.76±0.07h4.4±0.12i

由表4可知，除菌株HQ 3-2、HQ 3-3、SR 15-1、SR 15-2和LQ 14-2外，其他菌株与ck对比差异显著(p<0.05)，对青稞幼苗芽生长有促进作用。其中LQ 3-3菌液处理的芽长最长，为13.67 cm。菌株HQ 3-5、HQ 7-4、HQ 36-2、SR 6-2、SR 19-1、SR 20-2和LQ 3-3与ck对比(如表5)，芽长增加分别为23.29%、27.12%、14.60%、22.05%、30.02%、21.43%和41.55%。菌株HQ 3-5和HQ 7-4培养液处理的种子根长到达6.8 cm，分别比ck根长增加89.31%、86.30%(如图1，图2)。菌株SR 15-1菌液的处理对芽生长有抑制作用，同时对幼苗的地下部分有明显的抑制作用，与ck对比(如表5)芽长及根长分别下降 57.56%和 51.60%。

由表5可知，各菌株菌液处理中对黑青稞幼苗的须根数有一定的促进作用但是效果不明显。SR 6-2、SR 19-1和SR 20-2菌液处理中茎粗比ck增加20%以上，其中SR 6-2菌液处理茎粗达到2.04 mm；不接菌的培养液处理对青稞幼苗的芽长、根长、茎粗及须根数有抑制作用。

表5 不同菌株菌液处理下茎粗、芽长、根长及须根数变化量

菌株茎粗变化量(%)芽长变化量(%)根长变化量(%)须根数变化量(%)HQ3-214.98-23.71-10.415.66HQ3-3-5.91-11.8018.633.84HQ3-52.9623.2989.321.89HQ7-416.4627.1286.303.84SR15-1-1.27-57.56-51.605.66SQ15-28.44-19.32-7.49-3.77LQ14-210.13-3.075.753.84HQ36-28.2314.6037.537.55SR6-229.1122.0535.625.72SR19-121.5230.0223.840SR20-221.0921.4316.44-1.89LQ3-312.0341.556.30-11.26

注：与ck对比的变化量。

4 结论与讨论

1) 试验结果表明：通过初筛和复筛，筛选出了活性较高的固氮菌、溶解无机磷细菌和溶解有机磷细菌各4株，固氮菌分别为菌株HQ 3-2、HQ 3-3、HQ 3-5和HQ 7-4，无机磷溶解细菌分别为菌株SR 20-2、SR 6-2、LQ 3-3和SR 19-1，有机磷细菌分别为菌株HQ 36-2、LQ 14-2、SR 15-2和SR 15-1。分别用以上菌株100倍菌液对黑青稞种子进行浸种处理，结果表明：不同菌株对青稞种子及幼苗的促生作用不同。菌株HQ 3-3、HQ 7-4和SR 15-2对黑青稞种子发芽促进作用显著，与对照相比发芽率分别增长了36.05%、29.07%和29.07%；菌株SR 19-1和LQ 3-3对青稞种子芽生长有显著的促进作用，分别较对照增加了30.02%和41.55%。菌株HQ 3-5和HQ 7-4对青稞幼苗地下部分生长有显著的促进作用，分别较对照显著增加了89.31%和86.30%。本试验也筛选出了同时对青稞种子萌发及幼苗生长都有促进作用的菌株固氮菌HQ 7-4、解有机磷菌株HQ 36-2、解无机磷菌株SR 6-2和SR 19-1，为青稞微生物菌肥的研制提供了功能菌株。

图2 HQ 7-4菌液处理与ck对比

2) 近年来，探寻新肥源 (微生物菌肥)以替代或部分替代化肥的研究越来越受到重视，而PGPR的促进植物生长，改良土壤其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类等功能，是微生物菌肥良好的原料之一[18-21]。PGPR菌肥研究取得研究成果较多，邱勤等[22]使用PGPR菌剂对新垦地土壤接种，显著提高了土壤的各项基本化学肥力指标。韩光等用复合型PGPR对土壤培肥效果研究表明，PGPR处理后，土壤有机质、全氮、全磷、全钾、有效磷和速效钾的分别提高了42.2%、58.8%、8%、12.6%、37.2%和 40.2%[23]。逄焕成等[24]用解钾细菌和芽孢杆菌的菌剂处理土壤，土壤中的有机质、全氮、有效磷和速效钾分别提高了55.9%、50.2%、71.4%和 28.9%。本研究筛选的功能细菌，有望研制出提高西藏土壤肥力的PGPR菌肥。

3) 作物种子的萌发受到许多外在和内在因素的影响，萌发状态影响着成苗率和幼苗质量，而成苗率和幼苗质量是播种质量的重要因素，也是提高田间植株质量的关键因素[25]。本研究用固氮、溶磷菌液处理黑青稞种子，通过发芽率、发芽势和发芽指数来说明种子活力的高低；以幼苗的茎粗、芽长、根长、须根数来说明菌液对幼苗的作用。

由于本试验所筛细菌具有多种促生能力，将这些细菌进行组合后，有望在西藏较为贫瘠的土壤上收到明显效果并得到应用。当然，需要进行菌株组合及温室盆栽试验，进一步研究证实。