辣木叶复方改善小鼠睡眠功能的实验研究

张久旭，刘洋，顾文宏，李梦薇，何军，赵保胜*

(1.北京中医药大学，北京 102488； 2.云南天佑科技开发有限公司，云南 芒市 678400)

辣木叶为辣木科辣木属植物辣木(MoringaoleiferaLam)的干燥叶子，全世界约有14个辣木品种[1]。辣木叶含有丰富的营养物质和药效成分，在印度已有上千年的食用历史，其提取物被广泛应用于食品、药品、化妆品中[2-4]。研究表明辣木叶具有降血糖、降脂、降压、抗肿瘤、抗氧化、抑菌、利尿、驱虫等作用[5-9]。

失眠，中医称为 “不寐”，主要是由气血阴阳失和或其他病证影响所致。而辣木改善睡眠作用的功效国外早已发现，并进行了相关的研究。通过实验发现辣木根的水提物对中枢神经系统具有抑制作用，在一定的剂量下可以降低大鼠的自发性活动[10]，辣木根的甲醇提取物也可以明显延长戊巴比妥钠诱导的大鼠睡眠时间[11-12]。

目前，改善睡眠的中药复方以酸枣仁、五味子、茯苓、当归、远志、甘草、丹参等药物使用为主，其中安神类保健食品的主要成分为酸枣仁提取物和五味子提取物[13-15]。实验所采用的辣木叶复方由辣木叶与酸枣仁、五味子、远志、丹参组成。本文通过戊巴比妥钠小鼠睡眠时间实验和巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期实验，观察辣木叶和辣木叶复方对小鼠睡眠功能的影响，并观察不同配伍比例的辣木叶复方改善睡眠的作用。辣木叶的作用广泛，但多用于功能食品，对于药效学研究相对较少。本研究有望证明其对亚健康的确切疗效，为辣木叶及其复方成药性提供实验依据和参考。

1 材料

1.1 仪器

RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；HH-2恒温水浴锅(江苏省金坛市晨阳电子仪器厂)；DZF真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；KQ5200超声波清洗仪器(300 w，40 kHz，宁波新芝生物科技股份有限公司)；岛津高效液相色谱仪(LC-16，日本岛津公司)；CPA225D电子分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)。

1.2 试剂与药材

辣木叶(由合作企业云南天佑科技开发有限公司提供)，经北京中医药大学中药鉴定系张贵君教授鉴定为辣木科植物辣木MoringaoleiferaLam的干燥叶；酸枣仁(批号：1503009)，经北京中医药大学中药鉴定系张贵君教授鉴定为鼠李科植物酸枣ZiziphusjujubeMill.var.spinosa (Bunge) Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子；五味子(批号：1702047)，北京中医药大学中药鉴定系张贵君教授鉴定为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill. 的干燥成熟果实；远志(批号：17020448)，北京中医药大学中药鉴定系张贵君教授鉴定为远志科植物远志PolygalasibiricaL.的根；丹参(批号：1701027)，经北京中医药大学中药鉴定系张贵君教授鉴定为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根；以上四种饮片均由北京太洋树康中药饮片厂提供。戊巴比妥钠(分析纯，批号：20170611)购买于上海伊卡生物技术有限公司；巴比妥钠(分析纯，批号：570471)购买于北京虹湖联合化工产品有限公司；乙腈(色谱纯，Fisher公司，批号：164790)；甲醇(分析纯，北京化工厂，批号：20170209)；磷酸(分析纯，北京化工厂，批号：20160111)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司，批号：201102GQ07547)；异槲皮苷(纯度92.9%，111809-201403)购买于中国食品药品检定研究院；紫云英苷(纯度99.5%，批号：Y27J7H9634)购买于上海源叶生物科技有限公司；丹酚酸B(纯度99.5%,批号：ST00050120MG)购买于上海诗丹德标准技术服务有限公司。

1.3 实验动物与分组

SPF级ICR小鼠180只，雌雄各半，体质量18～22 g，由北京斯贝福生物科技有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2016-0002。实验前小鼠适应性喂养1周，自由饮水和进食。

将ICR小鼠按体质量随机分为延长戊巴比妥钠睡眠时间和缩短巴比妥钠睡眠潜伏期两个实验组，每个实验组90只，雌雄各半。每个实验组又按体质量随机分为模型对照组、辣木叶低剂量(1.3 g/kg)组、辣木叶中剂量(2 g/kg)组、辣木叶高剂量(2.6 g/kg)组，酸丹五远组(1.2 g/kg)，复方组合①(辣木叶1.3 g/kg+酸丹五远1.2 g/kg)组、复方组合②(辣木叶2 g/kg+酸丹五远1.2 g/kg)组、复方组合③(辣木叶2.6 g/kg+酸丹五远1.2 g/kg)组，共8组，每组10只。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备

取异槲皮苷10.56 mg、紫云英苷10.16 mg、丹酚酸B10.23 mg于10 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，做储备液。精密吸取异槲皮苷储备液1.74 mL，紫云英苷储备液0.94 mL，丹酚酸B储备液0.96 mL于5 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，做混合对照品溶液，备用。

2.2 供试品溶液的制备

分别取辣木叶中剂量组提取物、酸丹五远提取物、不用配伍比例辣木叶复方提取物各0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇溶液，称重。超声30 min后取出，冷却至室温，再次称重，加入纯甲醇补足缺失的重量。用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱为Cosmosil-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为B(乙腈)-A(0.1%磷酸水)，梯度洗脱，洗脱程序为：0 min 20%B，16 min 20%B，26 min 40%B，29 min 40%B，30 min 20%B，36 min 20%B，流速为1.3 mL/min，柱温为40℃，检测波长为260 nm，进样量为10 μL。

2.4 受试药物的制备

辣木叶提取物的制备：称取辣木叶97.93 g于2 000 mL圆底烧瓶，加入100 mL蒸馏水，浸泡2 h。回流提取2 h，保持微沸状态，用纱布过滤，收集初滤液，再加入1 000 mL蒸馏水，回流提取2 h，合并两次的滤液，旋转蒸发浓缩至一定体积，将浓缩后的药液倒入蒸发皿中，移至60℃真空干燥箱中干燥至恒重，冷却至室温，得到辣木叶提取物。

辣木叶复方提取物的制备：以2倍处方量称取各药材(辣木叶、酸枣仁、丹参、远志、五味子)按不同的实验设计分别进行加热回流提取，放冷后过滤，静置过夜，去除沉淀得澄清液体，采用旋转蒸发仪浓缩至一定体积，将浓缩后的药液倒入蒸发皿中，移至60℃真空干燥箱中干燥至恒重，冷却至室温，得到辣木叶复方提取物。

去辣木叶复方提取物的制备：以2倍处方量称取各药材(酸枣仁、丹参、远志、五味子)，按不同的实验设计分别进行加热回流提取，放冷后过滤，静置过夜，去除沉淀得澄清液体，采用旋转蒸发仪浓缩至一定体积，将浓缩后的药液倒入蒸发皿中，移至60℃真空干燥箱中干燥至恒重，冷却至室温，得到去辣木叶复方提取物。

2.5 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验

每天上午8-10点按体质量灌胃给药，模型对照组给予等积体的蒸馏水，连续灌胃给药2周。于最后一次给药后30 min，各组小鼠按50 mg/kg腹腔注射戊巴比妥钠，以翻正反射消失30 s以上作为进入睡眠的判断标准，以翻正反射再现为睡眠结束，观察记录注射戊巴比妥钠后各组小鼠的睡眠时间(翻正反射消失至翻正反射再现的时间)，进行组间比较。

2.6 巴比妥钠睡眠潜伏期实验

每天上午8-10点按体质量灌胃给药，模型对照组给予等积体的蒸馏水，连续给药2周。于末次给药后30 min，各组小鼠按250 mg/kg腹腔注射巴比妥钠，以翻正反射消失30 s以上作为入睡判断标准，以翻正反射再现为睡眠结束，观察记录注射催眠剂量巴比妥钠后各组小鼠的睡眠潜伏期(注射巴比妥钠至翻正反射消失的时间)，进行组间比较。

2.7 数据处理及统计分析

3 结果

3.1 专属性试验

在“2.3”色谱条件下测得空白辅料、对照品和辣木叶、去辣木叶组、及辣木叶复方谱图见图1，各样品含量见表2，对照品异槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B，保留时间分别为9.985、14.872、24.973 min，表明该体系中辅料和其它成分均不干扰待测物的测定。从高效液相色谱法含量测定结果来看，按日服用生药量计算，三个复方组合中异槲皮苷和紫云英苷较单味药辣木叶的含量有所下降，只有复方组合③的异槲皮苷含量明显增高，但是丹酚酸B的含量在三个复方中都有所增高，以复方组合②最为显著。

图1 HPLC色谱图

样品异槲皮苷含量(mg·g-1)紫云英苷含量(mg·g-1)丹酚酸B含量(mg·g-1)辣木叶低剂量31.82915.549—辣木叶中剂量48.96823.921—辣木叶高剂量63.65931.097—酸丹五远——14.74复方组合①22.81710.41918.304复方组合②42.77620.97463.499复方组合③88.71318.13927.387

3.2 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验

腹腔注射戊巴比妥钠后，模型组小鼠均出现睡眠现象。给药2周后，与模型组比较，辣木叶复方组合①和②均明显延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠持续时间(P<0.05或P<0.01)；而辣木叶低剂量、中剂量、高剂量组以及酸丹五远组及复方组合③组与模型组比较，小鼠睡眠持续时间有延长趋势，但未出现统计学差异，具体结果见表1。

表1 辣木叶及其复方对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠持续时间的影响

注：与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01

3.3 巴比妥钠睡眠潜伏期实验

腹腔注射巴比妥钠后，模型组小鼠均出现睡眠现象。各给药组与模型组比较，小鼠的睡眠潜伏期均明显缩 短，差异具有显著性(P<0.001)，具体结果见表2。

表2 辣木叶及其复方灌胃给药对巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期的影响

注：与模型组比较,**P<0.01

4 讨论

辣木叶是药食同源的植物，在国外具有悠久的药用历史，广泛用于罗马人、希腊人和以及乌纳尼人和锡达人的医疗系统，我国于20世纪60年代引入辣木，目前在云南和广东等地有所种植[16-18]。国内对辣木叶的药用价值研究相对较少，目前大部分的研究认为与其药效作用相关的化学成分主要是辣木叶中的黄酮类和多酚类，但其确切的有效成分和作用机制还尚不清楚[19]。本实验选取辣木叶中含量较高的成分异槲皮苷和紫云英苷做为指标性成分，其中异槲皮苷具有一定的抗氧化、抗肿瘤和抗血小板凝集作用，从而具有一定的大脑保护作用[20]，紫云英苷则具有抗炎、抗过敏、镇痛、抗菌、抗肝毒、抗心律失常、扩张血管、保护心肌的作用[21]，这些作用可能与其改善睡眠的机制有关。而丹酚酸B是丹参提取物中的主要水溶性成分之一，研究表明丹酚酸B具有多种药理作用，能够改善心肌缺血，同时对心肌梗死具有很好的保护作用[22]，在治疗心脾两虚型的失眠症中有很好的疗效[23]。

在三个不同配伍比例的辣木叶复方中，药理作用显著的复方②在三个化合物的含量上，紫云英苷和丹酚酸B的含量较高，而异槲皮苷含量适中，可见中药复方的药效并不是与化合物含量呈绝对正相关，与其配伍比例有着重量的联系。方药配伍比例的变化严重影响了其功效，同样的配伍在使用不同的配伍剂量后，可能会产生不用的药理效应，甚至改变方药的药效，故而有“汉方不传之秘在量上”之说[24]。因此配伍比例的研究也是探讨配伍规律的一个重要方面。

在延长戊巴比妥钠睡眠时间实验中，辣木叶组和酸丹五远组与模型组相比没有显著性差异，但是出现了延长睡眠时间的趋势，说明其具有一定的改善睡眠功效。辣木叶复方组则出现了明显的延长睡眠时间的作用，尤其是辣木叶复方②的作用更为明显，说明辣木叶与酸丹五远可能存在协同作用。

在巴比妥钠睡眠潜伏期实验中，各实验组与模型组比较均有显著性差异，且辣木叶复方②更为明显。从以上研究中分析，辣木叶复方具有改善睡眠功能的作用，其中以辣木叶复方组合②(辣木叶2 g/d+酸丹五远1.2 g/d)的作用更为明显。以上研究对于探讨辣木叶复方改善睡眠作用的化学物质基础具有一定参考意义，为辣木叶改善睡眠复方的进一步深入研究奠定了一定的基础。

随着时代的发展，生活压力的增大，越来越多的人患有失眠症。针对失眠症的综合治疗方法中，中药具有我国传统医学的特色与优势，安全性高、疗效较好，特别是中药类保健食品与药膳的可接受性强、无毒副作用，长期使用对失眠症确有一定疗效。实验证明，辣木叶复方对睡眠有一定的改善作用，但其改善睡眠作用的药理机制还有待于进一步深入研究。