绵羊细菌性腹泻病多重PCR方法建立与初步应用

陈浩林 徐景峨 蒲龄 余波 王璇 杨莉 朱冠群* 毛凤显

（1，贵州省畜牧兽医研究所 550005；2，贵州省畜禽遗传资源管理站 550001）

绵羊细菌性腹泻病是一种以腹泻为特征性症状的消化道疾病。国内相关试验研究表明，绵羊细菌性腹泻病的病因较复杂[1]，产气荚膜梭菌 （CP）、大肠杆菌 （E.coli）、沙门氏菌（SE）、多杀性巴氏杆菌 (Pm)等均可引起，常为混合感染。

产气荚膜梭菌在自然界分布极广，是一种条件性致病菌，可造成人食物中毒，引起各种动物肠毒血症、坏死性肠炎及创伤性气性坏疽等疾病[2]。产肠毒性大肠杆菌是一种嗜热、嗜酸、需氧菌，能引起肠黏膜细胞水与电解质的代谢紊乱，是导致羔羊腹泻的主要病因之一[3]。肠炎沙门氏菌是引起胃肠炎和食物中毒的主要病原菌之一[4]，随着由SE引起病例的上升，不仅严重阻碍了养羊业的发展，还威胁人畜健康，已成为公共卫生所关注的问题。羊多杀性巴氏杆菌病又称羊出血性败血病，由多杀性巴氏杆菌引起的急性传染病。临床主要表现为高热、肺炎、急性胃肠炎及内脏器官广泛出血为特征[5]。

绵羊细菌性腹泻主要的检测方法有细菌的分离鉴定、血清学鉴定、PCR等方法，然而常规的诊断方法很难将此症状相似的疾病加以区别，而且常规的病原学和血清学检测方法又存在操作繁杂、费时费力、敏感性低等不足。多重PCR（multiplex PCR，mPCR）诊断方法可以对病原菌进行全面、系统、准确的检测与鉴定，且操作简单、快速，具有很高的特异性和灵敏度，检测成本低，适合大量临床样品 （特别是混合感染样品）中病原体的快速诊断，从一份样品中同时检测出多种病原体[6]。

本研究拟建立一种能同时检测CP、E.coli、SE、Pm的多重PCR方法，对临床样品进行简便、快捷、灵敏、准确的检测，为绵羊细菌性腹泻病的防制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

产气荚膜梭菌 A型 （CVCC41）、产气荚膜梭菌 B型（CVCC1145）、产气荚膜梭菌C型 （C59-30）、产气荚膜梭菌D型 （CVCC84）、产气荚膜梭菌E型 （E型魏氏梭菌）、多杀性巴氏杆菌 （CVCC494）、大肠杆菌 （CVCC1542）、大肠杆菌（CVCC215）均购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心；肠炎沙门氏菌 （SE）、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、结核杆菌为贵州省畜牧兽医研究所畜禽疫病研究室保存。

1.2 主要试剂

Goldview I型核酸染色剂、D2000、EDTA、Tris、Taq DNA Polymerase （5U/μL） 及相应 10×Taq Buffer、 dNTP 等购自宝生物 （大连）工程有限公司。TIANamp粪便基因组DNA提取试剂盒、TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由宝生物 （大连）工程有限公司合成。

1.3 引物设计

根据GenBank中登录的产气荚膜梭菌 （CP）α毒素基因、大肠杆菌 （E.coli）K99菌毛毒力因子、肠炎沙门氏菌 （SE）外膜蛋白A基因 （ompA）、多杀性巴氏杆菌 (Pm)K基因序列，应用DNAStar软件，设计了4对引物，用于扩增CP、E.coli、SE、Pm目的基因片段，引物的序列 （见附表）。

1.4 细菌基因组抽提

待检样品如肠内容物、新鲜粪便等组织样品的提取参照TIANamp粪便基因组DNA提取试剂盒说明书进行；细菌DNA的提取参照TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA于-70℃保存。

1.5 单一细菌PCR扩增

单一细菌的PCR反应在25μL体系中进行，Primer1/2各2μL、 10×Taq Buffer 5μL、 dNTP mixture 4μL、 Taq DNA polymerase0.5μL、 ddH2O 加至 25μL， 反应程序： 94℃ 5min； 94℃30s， 53℃ （CP）、 52℃ （E.coli）、 55℃ （SE）， 55℃ （Pm） 40s，72℃40s，30个循环；最后72℃延伸7min。取8μLPCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

附表 引物序列

1.6 多重PCR反应条件的优化

对多重PCR反应条件优化，包括退火温度 （52～56℃），引物浓度 （5～20μmol/L）， Taq DNA polymerase浓度 （0.5～3.5U），以确定最佳反应条件，同时以双蒸水作为空白对照。采用100μL 反应体系， 即 10×Taq Buffer 20μL， dNTP mixture 16μL；Taq DNA polymerase 2μL，用双蒸水补足至100μL。反应条件为： 94℃ 5min； 94℃ 1min， 52～56℃ 1min， 72℃ 1min， 30 个循环；最后72℃延伸7min。取8μL PCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

1.7 敏感性试验

将提取的细菌组DNA用蛋白质核酸仪测定浓度后，人为将4种细菌DNA混合，经5倍系列稀释的细菌DNA用于多重PCR反应；经10倍系列稀释的细菌DNA用于单一细菌的PCR反应。

1.8 特异性试验

以CP、E.coli、SE、Pm为模板进行多重PCR反应。

1.9 重复性试验

应用建立多重PCR方法，重复检测CP、E.coli、SE、Pm单一细菌DNA或人为混合DNA样品3次以检验结果的可靠性。

1.10 多重PCR对临床样品的检测

对2015～2017年贵州省毕节地区10个规模化养羊户和养羊专业户采集的1094份病料进行检测。细菌DNA的抽提参照1.4，同时进行多重PCR和单一细菌PCR检测。

2 结果

2.1 PCR产物的鉴定

CP、E.coli、SE、Pm的PCR扩增片段经胶回收，送大连宝生物工程有限公司测序，结果表明，扩增片段分别为各细菌的特异性条带。

2.2 多重PCR反应

在100μL反应体系中，多重PCR的最佳反应条件为：退火温度53℃，Taq DNA polymerase1U，引物浓度10μmol/L。用产气荚膜梭菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌的特异性引物均有效扩增出了其目的片段，分别为258bp、151bp、384bp和585bp，无非特异性片段产生。

2.3 敏感性试验

在多重PCR反应中，细菌DNA最低检测量分别为羊魏氏梭菌6.0ng/L、大肠杆菌4.0ng/L、肠炎沙门氏菌0.4ng/L、多杀性巴氏杆菌4.0ng/L。在单一细菌的PCR反应中，各细菌的最低检测量分别为羊魏氏梭菌0.6ng/L、大肠杆菌0.4ng/L、肠炎沙门氏菌0.04ng/L、多杀性巴氏杆菌0.4ng/L。

2.4 特异性试验

以铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、结核杆菌为模板分别进行多重PCR反应均未扩增出条带，而CP、E.coli、SE、Pm混合DNA均扩增出各细菌的特异性条带。

2.5 重复性试验

应用建立的多重PCR方法，重复检测CP、E.coli、SE、Pm单一DNA或混合DNA样品3次，结果均一致。

2.6 多重PCR对临床样品的检测

利用建立的CP、E.coli、SE、Pm多重PCR及单一细菌PCR方法对1094份临床病料进行检测。1094份病料中有189份 CP阳性，阳性率最高，为17.27% （189/1094）；175份E.coli阳性，阳性率为15.99% （175/1094）；101份SE阳性，为 9.23% （101/1094）； 33份 Pm 阳性， 为 3.01% （33/1094）。其中CP、E.coli、SE混合感染15份；CP、E.coli混合感染43份；E.coli、SE混合感染29份。其结果与单一细菌PCR检测结果的符合率为100%。

3 讨论

产气荚膜梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌等病严重危害养羊业的发展，其共同致病特征均能导致绵羊细菌性腹泻。随着分子生物学的发展，PCR方法已经成为众多病原检测和分析的主要手段。本研究建立的多重PCR可以在同一个反应体系中同时检测4种细菌，能对临床样品中CP、E.coli、SE、Pm单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定，结果表明，该诊断方法敏感性好、特异性高，具有广阔的应用前景，在某种程度上还可以为研究这4种细菌之间在羊群中感染关系提供科学依据。

产气荚膜梭菌α毒素是产气荚膜梭菌最主要的毒素和致病因子之一[7,8]，其编码基因 (α-toxin)存在于所有型的产气荚膜梭菌基因组中。产肠毒素大肠杆菌的毒力因子主要有菌毛 （主要有K99、F41、F17）和肠毒素。其中K99菌毛蛋白具有黏附于小肠绒毛上皮刷状缘的K99菌毛特异性的受体，使细菌牢固地定居于小肠黏膜上，从而导致腹泻的发生，并具有良好的免疫原性[9]；肠炎沙门氏菌opmA又称热修饰蛋白，是肠炎沙门氏菌的主要外膜蛋白，在维持外膜结构上具有重要作用，且序列高度保守，具有良好的免疫原性[10]。Townsend等认为多杀性巴氏杆菌的KMT1基因在所有多杀性巴氏杆菌中均存在，是多杀性巴氏杆菌独有的序列，即KMT1基因是多杀性巴氏杆菌的一个种特异性基因，KMT基因是Pm种特异性的DNA片段[11]。

多重PCR中引物的设计至关重要，本研究设计的引物是针对4种细菌各自相对保守的基因序列，分别是产气荚膜梭菌（CP）α毒素基因、大肠杆菌 （E.coli）K99菌毛毒力因子、肠炎沙门氏菌 （SE）外膜蛋白A基因 （ompA）、多杀性巴氏杆菌(Pm)K基因序列。在这4种细菌中，SE G+C含量较高，在设计引物时，CP、E.coli和Pm这3对引物在相近的退火温度进行多重PCR扩增是多重PCR反应成功与否的关键。

本研究中建立的多重PCR诊断方法，可以用于临床检测，从临床病料检测结果表明，产气荚膜梭菌和大肠杆菌是引起细菌性腹泻的主要病因，这也是绵羊细菌性腹泻病防制的重点，因而免疫接种相关疫苗有助于降低腹泻的发生率。