猪繁殖与呼吸综合征病毒LJ株分离鉴定与免疫原性试验

张芷宁

猪繁殖与呼吸综合征是由猪蓝耳病病毒引起的一种以厌食、高热，怀孕母猪早产、流产、产死胎、木乃伊胎，并且各年龄段猪呼吸障碍为特征的高度接触性传染病。此病最早于1987年在美国发现。1991年，Wensvoot等首次从母猪体内及发病仔猪分离到该病毒，当时命名为Lelystad病毒。随后在英国、美国、德国等地区也分离到了此病毒。目前，该病已在全世界范围内传播，并且遍及欧洲及北美洲。在我国，郭宝清等在1996年首次从疑似蓝耳病患猪群中分离到蓝耳病毒，证实了蓝耳病在我国的流行。该病传播迅速，在经济发达国家，随着猪群密集增加、流动频繁，更容易导致此病的流行。

本研究采集某猪场具有高热症状病猪的病料，并从此病料中分离到一株病毒，将该病毒接种到Marc-145细胞上，发现此病毒可以在Marc-145细胞上增殖，并且产生以圆缩、聚集、脱落为特征细胞病变。经RT-PCR鉴定以及间接免疫荧光试验，结果证实该病毒为美洲型PRRSV，将其命名为PRRSV LJ株。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样本及试验用用细胞

采集发病猪场高热死亡仔猪的肺脏及淋巴结，置于-70℃超低温冰箱中保存备用。Marc-145细胞由本研发中心保存。

1.1.2实验动物

选取3-4周龄PRRSV抗体阴性健康仔猪25头，并且经检测无伪狂犬病野毒抗体，购自哈尔滨市阿城某养殖场。

1.1.3实验试剂

胎牛血清購自山东劲牛，MEM细胞培养基购自Gibco公司。

1.2方法

1.2.1病毒分离与鉴定

1.2.1.1病料的处理

将病料剪成一定体积的大小，加入含5%血清的MEM，研磨成匀浆，然后12，000rpm 4℃离心10min，用0.22岬滤器对上清进行过滤除菌。

1.2.1.2 RNA提取

1）准备一离心管，移取5μLpoly（A）到管底，移取200μLRLS液到管内，然后在离心管内分别移入200μL样品，再加入25μLproteinase K。盖上盖子，彻底混匀后，55℃消化10-20分钟。

2）加入200μL无水乙醇，颠倒离心管以混匀。

3）全部加入吸附柱中，9，000g离心1 min。倒掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管中。

4）加入500μLRP液，静止1min，离心1 min，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中。

5）加入600μLW3液，离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管中。

6）加入250μLW3液，静止1 min后，离心2min。

7）将吸附柱移入一个干净的1.5mL离心管内，在吸附膜中央加入25-50μL水静置1 min，离心2min，轻微混匀后，贮存于-70℃备用。

1.2.1.3引物的设计

参考（童光志，2007年）合成2对引物，使用该引物进行RT-PCR对病料或细胞培养物进行病毒核酸的检测。引物由上海生工生物工程有限公司合成（见表1）。

1.2.1.4 RT-PCR

RNA的反转录程序：

反转录体系为25μL，RNA模板11.0μL，引物（50pmol/μL）2.0μL，70℃水浴5min，冰浴5min，再加入5xM-MLV RTBuffer 5.0μL，dNTP（2.5mmol/L）5.0μL，RNAase抑带剂1.0μL，鼠源反转录酶（M-MLV RT）1.0μL，42℃水浴90min，70℃水浴15min，-20℃保存备用。

反应体系25μL：10xPCRBuffe r 2.5μL，2.5 mmol/L dNTP 2.5μL，上下游引物（10pmol/μL）各1μL，模板1.0μL，5U/μL rTaq 0.5μL，灭菌去离子水补足。

反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸7min，4℃终止反应。

1.2.1.5 PRRSV的分离与培养

RT-PCR检测为阳性的病料上清过滤除菌后，接种于已长至90%的单层Marc-145细胞上，每个T-25细胞瓶1mL，放入37℃的5%CO2培养箱中孵育1h，弃上清并加入含2%胎牛血清的DMEM9mL继续37℃培养。每日观察细胞病变情况，当细胞出现80%以上的细胞病变（CPE）时，收毒，冻融3次后继续盲传至第三代。每个代次抽取小样，96孔细胞板测定TCIDso。

1.2.1.6免疫荧光技术鉴定

对出现病变的细胞培养物进行10倍稀释，然后接种到长满单层Marc-145细胞的96孔板内，5%CO2培养箱内37℃培养2-4d，并设立阴性细胞对照，培养结束后，将细胞培养物用预冷的丙酮固定10min，然后使用PBS进行冲洗，冲洗3次，放置室温使其自然晾干，然后保存于4℃备用。将固定好的96孔培养板取出，每孔加入50μL20倍稀释的PRRSV阳性血清，置于湿盒中，使其在37℃作用45 min，然后清洗3次，5min/次，之后每孔加入100倍稀释的FITC-兔抗猪IgG，置于湿盒中，使其在37℃作用45 min，然后清洗3次，5 min/次，清洗后置于室温自然晾干，在荧光显微镜下观察。

1.2.1.7序列分析

把PRRSV阳性的病料及分离毒株的Nsp2片段和ORF5全基因序列进行扩增测序，然后与GenBank中的PRRSV序列进行比较并制作基因序列进化树。

1.3 PRRSV LJ株免疫原性试验

1.3.1试验分组及试验方案

选取3～4周龄PRRSV抗体阴性仔猪25头，随机分成5组，5头/组，A、B、C、D组分别免疫2mL病毒含量为107.0TCIDso、106.OTCID50、105.0TCIDso和104.0TCIDso的灭活苗免疫，E组为空白对照组，免疫经过乳化的DMEM培养基2mL，所以免疫均采用颈部肌肉注射。于免疫后1、2、

3、4周分别采血，用ELISA方法测定蓝耳抗体水平。

1.3.2攻毒方案

在免疫28d后，各组猪只颈部肌肉注射3mL PRRSV LJ株强毒（105TClD50/mL），攻毒后第二天开始逐日测体温，并观察记录临床表现，所有猪只在攻毒前及攻毒后3周进行称重，在攻毒后的1d、2d、3d、5d、7d、14d、21d进行采血检测PRRSV。28d时所有猪只进行扑杀，采集心脏、扁桃体、淋巴结、脾脏、肺脏及肾脏，检测组织中的PRRSV。

2结果

2.1猪繁殖与呼吸综合征病毒分离

将处理好的病料按3%接种于长满单层的Marc-145细胞，置于37℃进行培养，接种后3～4d，在显微镜下可观察到以圆缩、聚集、脱落为特征细胞病变（图1）。

对Marc-145细胞第3代病毒培养液进行RT-PCR扩增，得到2条大小分别为640 bD和796bp扩增条带，经对比得知，此条带大小与目的片段大小一致（见图2）。

2.2 PRRSV分離株的IFA鉴定

对Marc-145细胞第3代病毒培养液进行间接免疫荧光检测，可以观察到接种病毒的细胞出现特异性绿色荧光，未接种病毒的细胞未见荧光（见图3）。

2.3序列分析

通过进化树分析得知分离病毒LJ株与2006年分离的高致病性蓝耳病毒株的序列遗传关系较近。

2.4免疫原性结果

2.4.1免疫不同病毒含量灭活疫苗后的抗体检测

将所有实验猪按照上述方法采血，进行抗体检测，OD值>0.42可判为阳性，OD值<0.38可判为阴性，0.38

2.4.2攻毒后临床和体温观察

攻毒后3d开始，A、B、C组体温正常。而D组与E组则出现体温明显升高，体温都在40.5℃以上，并且体温升高持续时间较长（图4）。

攻毒后D组与E组仔猪出现呼吸困难，咳喘，耳尖发绀，体温升高，而A、B、C组未出现明显的临床症状。

2.4.3攻毒后病毒血症情况

采集仔猪攻毒前、攻毒后1d、2d、3d、5d、7d、14d、21d、28d的血液，提取病毒核酸，检测血液中的PRRSV。结果见表3，从结果可以看出A组仅有1头猪在攻毒后第2d的血液中检测到PRRSV，但在14d后，血液中检测不到PRRSV；而其它组的猪几乎全部能检测到PRRSV，并且部分猪的病毒血症一直持续到28d，由此可见免疫该疫苗能减少猪的病毒血症，并且在一定程度上缩短病毒血症的时间，抵抗病毒的增值。

2.4.4不同组织中PRRSV检测结果

攻毒后28d时所有猪只进行扑杀，采集心脏、扁桃体、淋巴结、脾脏、肺脏及肾脏，检测组织中的PRRSV结果（表4），显示：D组和E组所有猪的组织中都有PRRSV存在，C组和B组各2头猪从淋巴结和脾脏检测到PRRSV，但在脑组织和肾脏组织中未检测到PRRSV，表明A、B、C组疫苗免疫后能有效降低猪体的带毒。

4结论

本研究利用本实验室从临床发病猪组织分离鉴定的滴度较高的PRRSV LJ株。在本动物猪上进行了该毒株的免疫原性试验，结果表明，使用该疫苗能提供坚实的保护，为我国蓝耳病的防控提供有效的措施和方案。