屎肠球菌CCTCCM2017191发酵培养基的优化

■景宇超 马丰英 杨 倩 蒋贻海*

（1.南京农业大学动物医学院，江苏南京210095；2.青岛蔚蓝生物股份有限公司国家动物用保健品工程技术研究中心，山东青岛266111）

由于抗菌药的不合理使用，加大了畜禽产品中药物残留，耐药菌株也随之增加。抗菌药不仅对有害菌具有灭杀作用，其对肠道内的正常微生物群也有抑制和杀灭作用，长期使用会导致胃肠道正常菌群失调，引起动物内源性感染或二重性感染[1]。长此以往，将严重影响养殖业持续发展，对人类食品安全和抗菌药资源利用是一种巨大威胁。因此，微生态制剂应运而生，微生态制剂是指利用活的肠道益生菌或其菌体成分及代谢产物或能促进肠道微生物生长繁殖的物质制成的制剂[2]。能够调节和维持动物肠道微生态平衡，抑制有害菌的生长、提高机体代谢以及饲料吸收率，有助于畜禽生长，而且无毒、无耐药性，是抗菌药的理想替代品[3-4]。

乳酸菌是一种应用已久的益生菌，种类有200多种，其中一些乳酸菌也是肠道微生物的固有益生菌群[5-6]，乳酸菌具有多种生物学作用，包括促进肠道对营养物质的吸收，增强抵抗力，抑制外源有害菌等[7]。屎肠球菌属于乳酸菌，是肠球菌属，革兰阳性菌[8]，需氧或兼性厌氧；是动物肠道正常菌种之一，在肠道微生物群中维持一定比例，与其他肠道益生菌相互协作共同维持宿主的正常生理功能[9]。屎肠球菌是我国农业部公布的饲料添加剂目录中允许使用的微生物菌种。据报道益生肠球菌在体内发酵可产生大量乙酸和乳酸，使肠道内容物的pH值下降，从而拮抗病源性细菌的生长繁殖；同时可以产生细菌素，对食物中的腐败微生物或有害病原菌起到杀灭作用。因此，屎肠球菌在微生态制剂方面具有广阔的应用前景[10]。

目前对乳酸菌属的菌种均采用MRS培养基进行发酵培养[11]，为实现屎肠球菌的工业化生产，提高其发酵活菌量，本文对屎肠球菌CCTCCM2017191在MRS培养基的基础上进行了培养基优化，利用单因素试验，Plackett-Burman试验，最陡爬坡试验以及中心复合序贯试验与响应面分析法成功优化了屎肠球菌CCTCCM2017191的发酵培养基配方，实现了屎肠球菌CCTCCM2017191的高密度发酵。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

青岛蔚蓝生物股份有限公司国家动物用保健品工程技术研究中心分离得到的屎肠球菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种编号为CCTCC NO:M2017191。

1.1.2 试剂

酵母浸粉、胰蛋白胨（北京双旋微生物培养基制品厂）；牛肉浸粉、琼脂糖（青岛高科园海博生物技术有限公司）；K2HPO4·3H2O、柠檬酸氢二铵、硝酸钠、硫酸铵（国药集团化学试剂有限公司）；麦芽糊精、鱼蛋白胨、低聚异麦芽糖、玉米浆干粉（上海瑞永生物科技有限公司）；结晶乙酸钠、MgSO4、MnSO4·H2O、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉（天津市巴斯夫化工有限公司）；吐温-80（天津市瑞金特化学品有限公司）；氯化钠、氯化氢、氢氧化钠（天津市北辰方正试剂厂）。

1.1.3 试验仪器与设备

超净工作台（苏州净化设备有限公司）、高压蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司）、隔水式恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、恒温摇床（上海福玛实验设备有限公司）、电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）、WGZ-2XJ细菌浊度计（上海昕瑞仪器仪表有限公司）、pH计（瑞士梅特勒-托利多有限公司）。

1.1.4 基础培养基

MRS液体培养基：K2HPO42.0 g/l、结晶乙酸钠5.0 g/l、MgSO40.2 g/l、MnSO4·H2O 0.04 g/l、柠檬酸二胺 2.0 g/l、葡萄糖20.0 g/l、酵母浸粉4.0 g/l、牛肉浸粉8.0 g/l、胰蛋白胨10.0 g/l、吐温-80 1.0 g/l，121 ℃灭菌15 min。MRS固体培养基是在液体培养基的基础上添加琼脂糖14 g/l，121℃灭菌15 min，冷却至不烫手即可倾倒平皿。

1.2 试验方法

1.2.1 屎肠球菌菌种活化

将屎肠球菌的保藏菌液于MRS平板培养基上三区划线，置于37℃恒温培养箱培养24 h；挑取平板培养基上的单菌落接种于盛有100 ml液体MRS培养基的250 ml锥形瓶中，置于恒温摇床37℃、120 r/min培养12 h，最后再用此菌液在MRS平板培养基上三区划线，培养新的单菌落待用。

1.2.2 屎肠球菌生长曲线的测定

挑取屎肠球菌的单菌落接种于盛有100 ml液体MRS培养基的250 ml锥形瓶中，置于恒温摇床37℃、120 r/min培养12 h，然后将其以1%(v/v)的接种量接种到三瓶盛有150 ml MRS培养基的250 ml锥形瓶（30%装液量），于恒温摇床37℃、120 r/min培养，每间隔1 h用浊度仪测定锥形瓶中菌液浊度。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 屎肠球菌最适生长pH值的测定

挑取屎肠球菌的单菌落接种于盛有100 ml液体MRS培养基的250 ml锥形瓶中，置于恒温摇床37℃，120 r/min培养12 h，然后将其以1%(v/v)的接种量接种到30%装液量的不同pH值（pH值=5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）的MRS培养基，于37 ℃、120 r/min培养，12 h后测定不同pH值培养基条件下菌液浊度以及活菌数。

1.2.3.2 屎肠球菌的最适生长温度测定

挑取屎肠球菌的单菌落接种于盛有100 ml液体MRS培养基的250 ml锥形瓶中，置于恒温摇床37℃、120 r/min培养12 h。将配置的MRS培养基调节到最适pH值，然后将屎肠球菌以1%(v/v)的接种量接种到30%装液量最适pH值的MRS培养基中，分别置于不同温度（T=33、35、36、37、38、39、41 ℃）的恒温摇床中120 r/min培养12 h，然后测定不同温度下培养基中屎肠球菌的浊度以及活菌数。

1.2.3.3 最适碳源选择

使用不同碳源代替MRS培养基中的碳源进行单因素试验，以筛选最适合该屎肠球菌生长的碳源。所选碳源包括：果糖20 g/l、蔗糖19.5 g/l、乳糖19.5 g/l、麦芽糖19.5 g/l、低聚异麦芽糖20 g/l、麦芽糊精20 g/l、可溶性淀粉20 g/l，不同碳源的添加量是按照与MRS培养基中葡萄糖的含碳量一致的原则换算添加，另设MRS培养基为对照组。培养基调节至最适pH值，于最适温度下120 r/min培养12 h，然后测定不同碳源培养基中屎肠球菌的菌液浊度以及活菌数。

1.2.3.4 最适氮源选择

将MRS培养基中的碳源换为最适碳源，使用不同氮源代替MRS中的复合氮源（蛋白胨10 g/l、牛肉浸粉8 g/l、酵母粉4 g/l）进行单因素试验，以筛选最适合该屎肠球菌生长的氮源。筛选的氮源包括：蛋白胨19.18 g/l、牛肉浸粉 21.58 g/l、玉米浆干粉 57.5 g/l、鱼蛋白胨18.5 g/l、酵母浸粉37.0 g/l、硝酸钠15.69 g/l、硫酸铵12.21 g/l，各氮源的添加量是按照MRS培养基中复合氮源的含碳量添加的，另设复合氮源作为对照组。培养基调节至最适pH值，于最适温度下120 r/min培养12 h，然后测定不同氮源培养基对屎肠球菌的菌液浊度和活菌数的影响。

1.2.4 Plackett-Burman试验设计

根据单因素试验筛选出该屎肠球菌的最适碳源和氮源后，选取最佳碳源、最佳氮源、柠檬酸氢二铵、结晶乙酸钠、柠檬酸氢二钾、无水硫酸镁、吐温-80和硫酸锰共8个因子进行Plackett-Burman试验，以筛选影响屎肠球菌发酵活菌数的显著影响因子。

1.2.5 最陡爬坡试验

据Plackett-Burman试验的结果，选取具有显著影响效应的因子，根据显著影响因子的估计系数、正负效应，以及实际情况设计爬坡试验的方向和步长，设置不同梯度进行试验，以确定显著影响因子具有最大活菌数的浓度范围。

1.2.6 中心复合序贯设计与响应面分析

以Plackett-Burman试验所筛选的显著影响因子浓度作为自变量，菌液活菌数为响应值，最陡爬坡试验结果中具有最大活菌数的浓度梯度作为响应面设计的中心点，采用中心序贯设计法设计3因素3水平试验，运用响应面分析法得到各显著影响因子的最佳浓度。

1.2.7 优化配方检验

为了检验优化培养基的实际效果，将优化后的培养基与MRS培养基在相同条件下进行摇瓶发酵试验，统计试验结果，以验证回归模型是否可靠，屎肠球菌发酵培养基的优化是否成功。

1.2.8 数据处理与统计分析

试验结果的数据均以“平均值±标准差”的形式表示，利用SPSS 17.0软件对试验数据进行单因子方差分析(one-way ANOVA，LSD)，P＜0.05和P＜0.01认为数据在统计学上差异显著。Plackett-Burman试验、中心复合序贯试验的设计、数据分析、模型建立以及响应面分析均采用Minitab 16软件完成。试验作图采用Origin 9.0完成。

2 结果

2.1 屎肠球菌的生长曲线

根据所测菌液浊度绘制屎肠球菌CCTCCM2017191的生长曲线（见图1）。可以看出1～4 h屎肠球菌的菌液浓度没有很大的改变，这是其进入新环境的适应准备阶段，是屎肠球菌的迟缓期；4～12 h屎肠球菌的菌液浓度快速上升至顶峰，表明这是屎肠球菌生长繁殖最快的一个时期，此期为其对数生长期；12 h之后屎肠球菌进入生长稳定期，菌液浓度比较稳定，没有很大的变化。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 最适生长pH值的测定

根据屎肠球菌在不同pH值培养基中的生长状况（见图2）可知，培养基的pH值为8.0时屎肠球菌CCTCCM2017191具有最高的菌液浊度（P＜0.01），菌液活菌数也达到最高水平（P＜0.01），因此，确定该屎肠球菌生长的最适pH值为8.0。

图1 屎肠球菌的生长曲线

图2 pH值对屎肠球菌发酵活菌数的影响

2.2.2 最适生长温度的测定

图3 温度对屎肠球菌发酵活菌数的影响

由图3所示，屎肠球菌在37℃的条件下培养具有最高的菌液浊度（P＜0.01），并且活菌量（P＜0.01）可达最高，因此，确定该屎肠球菌的最适生长温度为37℃。

2.2.3 最适碳源的选择

屎肠球菌在不同碳源的培养基中培养12 h后测定菌液浊度以及活菌量，由图4可知，麦芽糊精对屎肠球菌CCTCCM2017191具有最好的培养效果，菌液浊度（P＜0.05）和活菌量（P＜0.01）都达到最高，因此，确定该屎肠球菌最适生长碳源为麦芽糊精。

图4 最佳碳源筛选

2.2.4 最适氮源的选择

不同氮源培养条件下屎肠球菌发酵量的差异比较大，由图5所示，无机氮源的活菌量最低，有机氮源中酵母浸粉的菌液浊度(P＜0.05)显著高于其他氮源，并且活菌量（P＜0.01）极显著高于其他氮源，因此，确定该屎肠球菌的最适生长氮源为酵母浸粉。

图5 最佳氮源筛选

2.3 Plackett-Burman试验设计结果

根据以上单因素试验结果，将筛选到的最佳碳源麦芽糊精和最佳氮源酵母浸粉代替MRS培养基中的葡萄糖和复合氮源作为优化培养基的成分，并将麦芽糊精、酵母浸粉、结晶乙酸钠、柠檬酸二铵、磷酸氢二钾、无水硫酸镁、硫酸锰、吐温-80共8个因子作为Plackett-Burman试验设计的基本因素，另设3个虚拟变量以估计试验误差，各因子取高低两个水平（见表1）进行试验并统计试验结果（见表2）。

表1 Plackett-Burman试验设计因子水平

对试验结果进行统计分析，可得各因子的效应及其显著性（见表3），可知正效应因子酵母浸粉（P＜0.01）和结晶乙酸钠（P＜0.05），负效应因子吐温-80（P＜0.05）在统计学上差异显著，具有显著影响效应，其余因子（P＞0.05）差异不显著，因此将这三个因子作为中心复合序贯试验的基本因素。

2.4 最陡爬坡试验

根据Plackett-Burman试验筛选结果，选取酵母浸粉、结晶乙酸钠、吐温-80为三个显著因子进行最陡爬坡试验以获取其在活菌数最高时的浓度区域。根据各因子的系数以及实际应用情况确定步长并设置七个梯度进行试验，由试验结果(见表4)可知，试验4所对应梯度的活菌数最高，所以选取酵母浸粉65.5 g/l、结晶乙酸钠6.75 g/l、吐温-80 1 g/l作为中心复合序贯试验的中心点。

表2 Plackett-Burman试验设计结果

表4 最陡爬坡试验设计及结果

2.5 中心复合序贯设计与响应面分析

采用中心复合序贯试验对酵母浸粉、结晶乙酸钠、吐温-80的浓度配比进行优化，以活菌数为响应值，试验4（见表4）作为中心复合序贯试验设计的中心点。各因子设置三个水平（见表5），共设计20组试验，其中14组为析因点试验，6组为中心点来估计试验误差，进行试验得到以下结果（见表6）。

表5 中心复合序贯试验设计因子水平

表6 中心复合序贯试验设计及结果

对试验结果统计分析并进行回归拟合，得到预测活菌数的回归拟合方程：Y=-985.596+8.423A+205.529E+127.024L-0.031A2-12.785E2-55.1L2-0.538AE-0.24AL。（Y为活菌数预测值，A、E、L分别代表酵母浸粉、结晶乙酸钠和吐温-80）对所得回归方程进行方差分析（见表7）可知：模型的回归项极显著（P＜0.001）表明本模型是有效的，失拟项不显著（P＞0.05）表明本模型不存在失拟现象，R-Sq与R-Sq（调整）比较接近，认为模型的拟合效果比较好；R-Sq（预测）比较接近于R-Sq值并且R-Sq（预测）值比较大，说明用此模型进行活菌数预测的效果可信。分析各项效应的显著性可知除一次项吐温-80和交互项乙酸钠×吐温-80不显著外，其余项均显著。

表7 回归拟合方程方差分析

绘制活菌数响应值的等值线图和曲面图（见图6和图7）可直观地看出各因子的交互作用对发酵活菌数的影响，从图中可看出活菌数响应值存在最大值，使用响应优化器计算活菌数的最大优化响应值可得在酵母浸粉77.22 g/l，结晶乙酸钠6.42 g/l，吐温-80 0.99 g/l时预测发酵活菌数有最大响应值为61.07×108CFU/ml。

2.6 优化配方检验

图6 酵母浸粉和结晶乙酸钠交互影响屎肠球菌活菌数的曲面图和等值线图

图7 酵母浸粉和吐温-80交互影响活菌数的曲面图和等值线图

为了检验优化结果的实际效果，将优化后的培养基与MRS培养基在相同条件下进行了5次摇瓶发酵试验，由统计结果（见图8）可知。屎肠球菌在优化培养基和MRS培养基中培养所达到的平均发酵活菌数分别为61.36×108CFU/ml和13.26×108CFU/ml，试验结果与预测值相近，证明回归模型可靠，成功实现了屎肠球菌培养基的优化。

3 讨论

微生物发酵培养基的优化试验以往多是采用单因素试验结合正交试验完成的，单因素试验法只是研究某一个因子对目标值的作用效果，不能探索因子间的交互作用，多用于试验中对众多因素的最初筛选。正交试验虽然可以得到培养基各组分浓度的最佳组合，但是无法找到整个试验区域内目标响应值的最优方案[12]。而Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验与中心复合响应面分析试验是一套成熟高效的优化试验设计方法，它能用较少的试验统计分析出达到目标响应值的最佳组合条件，弥补了正交试验的不足，在多种工艺优化试验方面已运用成熟，现在在微生物发酵[13-14]、有效成分提取等[15]方面的应用也越来越多。Plackett-Burman试验设计可以统计分析出整个试验中各因子的显著水平，从而确定出具有显著影响作用的影响因子以进行下一步试验[16]。最陡爬坡试验是一种在Plackett-Burman试验基础上的梯度试验设计方法，可以逼近显著因子最优响应值所在的响应区域，并以此作为中心复合试验的中心点，然后采用响应面分析法得到各因子的最优组合[17]。中心复合试验及响应面分析能够将试验结果与试验各因子进行统计回归，分析各因子间的相互关系，拟合出以试验结果为响应值的整体函数关系，通过响应值的回归模型得出各因子最优组合。

图8 培养基优化效果验证

屎肠球菌是一种农业部允许作为饲料添加剂使用的乳酸菌，具有调节动物肠道菌群平衡、促进营养物质吸收、增强抵抗力，提高生产性能等作用[18]。另外屎肠球菌也能够抑制其他有害菌的生长[19]。因此将其开发为动物微生态制剂，应用到畜禽养殖业，或是作为宠物肠道保健品应用于宠物行业，都会有很高的应用价值。而将屎肠球菌投入工业化生产的前提，必须提高其发酵活菌量，本研究利用单因素试验以及Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验与中心复合响应面分析试验对屎肠球菌CCTCCM2017191的发酵培养基进行了优化筛选。

研究发现，屎肠球菌CCTCCM2017191的发酵培养基最适pH值为8.0，最适发酵温度37℃，最佳碳源为麦芽糊精，最佳氮源为酵母浸粉。发酵活菌量的显著影响因子是酵母浸粉、结晶乙酸钠和吐温-80，经响应面分析法获得的优化高密度发酵培养基配方中酵母浸粉含量为77.22 g/l、结晶乙酸钠为6.42 g/l、吐温-80为0.99 g/l，其余成分含量保持不变，最终可得该屎肠球菌发酵最适培养基配方为：酵母浸粉77.22 g/l、结晶乙酸钠6.42 g/l、吐温-80 0.99 g/l、柠檬酸二铵2.0 g/l、磷酸氢二钾2.0 g/l、无水硫酸镁0.2 g/l、硫酸锰0.04 g/l、麦芽糊精20 g/l。经试验验证，优化培养基的发酵菌液活菌数可达6.136×109CFU/ml，与回归模型的活菌数预测值相符。优化结果是相同条件下MRS培养基菌液活菌数的4.63倍，成功实现了该屎肠球菌的高密度发酵培养。