饲用益生菌对仔猪生长性能和肠道菌群的影响

■韩 伟徐 晶王大为

(1.国家粮食局科学研究院中心实验室，北京100037；2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京102206)

微生态制剂（Microbial ecological agent，MEA）,是从天然环境中筛选出来的有益微生物菌种、经过培养后制成的活菌菌剂。广义上的微生态制剂应包括细菌、真菌、藻类及其代谢产物在内，可改善动物肠道环境和水体环境的微生态平衡，增强动物的免疫防御能力，抑制病原菌生长的生物制剂[1]。近年来，抗生素的过度使用与滥用，引发的药物残留和抗药性问题越来越多，而微生态制剂作为一种新型的绿色饲料添加剂已成为国内外的研究热点，向着加强应用推广、开发新型合理剂型、探索作用机制等方面发展[2-4]。

然而，微生态制剂（尤其是乳酸菌制剂）的应用效果受多种因素影响，如动物种类、生理状态、制剂的菌种组成、剂量、加工工艺、饲喂方法、温度和活菌制剂的保存时间等。所以，如何保证产品的稳定性和使用效果，开发更具实用价值的微生态制剂剂型是亟需解决的关键问题和难点。很多研究表明，日粮添加和饮水补给方式向动物补充益生菌，均能显著影响机体生长、代谢和免疫等。例如：短小芽孢杆菌（4D-14）制剂添加在肉鸡日粮中，能有效降低养殖后期料重比并促使各段肠管隐窝变短，使上皮细胞成活率上升，并可替代阿维拉霉素[5]。枯草芽孢杆菌、乳酪杆菌、异常汉逊酵母按2∶3∶2比例组成的制剂按0.5%～1.5%添加量加入仔猪日粮，腹泻率和死亡率明显降低，胃、空肠、结肠、盲肠中的乳酸菌数量显著增加（P＜0.05），而使胃和盲肠中大肠杆菌数量显著降低（P＜0.05），空肠、结肠、盲肠的肠壁厚度降低（P＜0.05），使空肠和盲肠的隐窝深度下降，而使结肠隐窝深度增加（P＜0.05）[6]。饮水中添加屎肠球菌或者轮换使用屎肠球菌和酸化剂对饮水量和采食量没有负面影响[7]。胡须蛋种鸡的日常饮水中按照500 g/t(每吨水添加试验品500 g)添加液态灭活乳酸菌制剂，在饮水中添加灭活乳酸菌制剂能够促进开产初期蛋鸡的生产性能、改善机体健康，鸡群产蛋率提高3.14%、合格蛋率提高2.11%，死淘率降低0.05%；经济效益方面的直接年只利提升达2.76元[8]。

本试验利用常见乳酸菌——屎肠球菌作为试验菌种，利用复合工艺制备微生态制剂，并添加于日粮和饮水，进而饲喂断奶仔猪，探讨该制剂对动物的生长性能和肠道健康的影响，为其在生产实践中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

屎肠球菌Ef3-4：实验室保藏。

1.1.2 种子及发酵培养基

白砂糖20 g，玉米浆干粉10 g，酵母浸膏5 g，MgSO4·7H2O 1.2 g，MnSO4·H2O 0.25 g，吐温-80 0.5 ml，豆油0.05 g，1 000 ml蒸馏水，用1 mol/l NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30 min。

1.1.3 ELISA试剂盒

购自武汉默沙克生物科技有限公司。

1.1.4 药品或试剂

海藻酸钠、氯化钙、柠檬酸、碳酸氢钠、水溶性淀粉、白砂糖、玉米浆干粉、酵母浸膏、豆油为食品级，其余药品或试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 微生态制剂的制备

①发酵液取得：取斜面菌种一环接于种子培养基摇瓶中，37℃、150 r/min摇床培养8 h后，按0.5%比例转接至另一同样液体培养基摇瓶中，37℃、180 r/min摇床培养8 h，再按1.5%比例转接至（不通氧）发酵罐，37℃、80 r/min培养12 h，得到发酵液。发酵液经管式离心（15 000 r/min，30 min）实现固液分离，其中的固体部分即为菌泥沉淀。②微囊化颗粒制备，方法见参考Han W等[9]；微囊化颗粒粒径≤3.35 mm。③泡腾颗粒制备：a.配方：菌泥1 kg，柠檬酸4 kg，碳酸氢钠3 kg，水溶性淀粉2 kg，蔗糖300 g，VC 20 g，甘油200 g，脱脂奶粉50 g。b.制法：将蔗糖、VC、甘油、脱脂奶粉先与微生物菌泥混合，冻干制菌粉；菌粉与柠檬酸、碳酸氢钠及水溶性淀粉均匀混合，干法制粒，备用；泡腾颗粒粒径≤2.36 mm。

1.2.2 成分与性质检测

活菌数检测，参照GB/T 4789.2—2010方法；微囊化颗粒抗逆性检验，方法见王婷婷[10]；泡腾颗粒性质检验，方法见参考宋怡敏[11]、杜小英[12]。

1.2.3 动物试验

试验动物：选用体重基本一致的35日龄健康仔猪150头，按性别和体重相近原则随机分成3个处理，每个处理5个重复，每个重复10头，每个重复单舍饲养。试验设计：处理1：抗生素组，日粮中添加抗生素(金霉素75 mg/kg)；处理2：益生菌组，日粮中添加0.1%的屎肠球菌Ef3-4发酵液（最终活菌数2×106CFU/g饲料）；处理3：微生态制剂组，日粮中添加0.1%的微囊化颗粒并在饮水中添加0.1%的泡腾颗粒。样品与数据收集：留取0、18 d和36 d粪便和血清样品，备用；同时，分别记录仔猪初重和36 d的饲料消耗量与体重，观察并统计仔猪腹泻状况。

1.2.4 肠道菌群多样性分析

使用DNA提取试剂盒（Omega Bio-tek Inc.,Nor⁃cross,GA,USA）提取粪便中细菌DNA，并PCR扩增其V3～V4 区 共 467 bp 的 片 段 。 引 物 ：338F，5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)-3’；806R，5’-GGAC⁃TACHVGGGTWTCTAAT-3’。PCR 体系：20 μl，4 μl的5×FastPfu Buffer，2 μl的2.5 mmol/l dNTPs，1.6 μl引物(5 μmol/l)，0.4 μl的 FastPfu 聚合酶及无菌超纯水。PCR产物送至北京微生太科技有限公司进行高通量测序（Illumina Miseq平台）。测序和分析方法参照参考文献[13-18]。

1.2.5 免疫性能分析

使用1.1中所述ELISA试剂盒，分析0、18 d仔猪血清样品中的Ig A、Ig G、Ig M、HSP-40。

1.2.6 数据处理

试验数据以“Mean±SD”表示，SPSS16.0进行数据拟合及方差检验。

2 结果与分析

2.1 微生态制剂成分与性质分析

通过微囊化工艺和泡腾工艺，分别制成微囊化颗粒和泡腾颗粒，并且在仔猪日粮和饮水中同时使用。该微生态制剂的成分与性质分析见表1。

由表1可见，微囊化颗粒的活菌数为1.0×1011CFU/g，在80℃高温和模拟胃液中活菌存活率分别达到85.0%和90.0%，表现出良好的抗逆属性。泡腾颗粒的活菌数为1.0×1010CFU/g，每5 g的发泡量和崩解时限分别为6.5 ml和5 min，崩解后pH值约为6.2，不但可以在短时间内溶解，而且对饮水的酸碱度影响小。此外，泡腾颗粒加入形式优于益生菌发酵液直接掺入饮水，原因在于发酵液中残留可溶糖、蛋白质、无机盐，同时改变饮水pH值，增加不确定因素且易于饮水传递；泡腾颗粒的优点还在于，易于饮水传递、避免堵塞饮水滤网，增加益生菌存活。

表1 微生态制剂的成分与性质分析

2.2 微生态制剂对仔猪生长性能的影响

微生态制剂按0.1%的添加量加入断奶仔猪的日粮和饮水系统，仔猪生长性能的结果见表2。

表2 添加微生态制剂对仔猪生长性能的影响

由表2可见，在饲养周期内，微生态制剂组与抗生素组相比，平均日增重和料重比无明显差异（P＞0.05）。微生态制剂组与益生菌组相比，平均日增重无显著差异（P＞0.05），而料重比显著降低3.7%（P＜0.05）。

2.3 微生态制剂对仔猪腹泻率和死亡率的影响(见表3)

表3 添加微生态制剂对仔猪腹泻和死亡率的影响

由表3可见，在饲养周期内，微生态制剂组与益生菌组、抗生素组相比，腹泻率分别显著降低6.6%(P＜0.05)和13.1%(P＜0.05)。

2.4 微生态制剂对仔猪肠道菌群的影响

3个饲喂处理组在不同生长时间点的粪便被收集，利用针对16S rRNA基因的高通量测序技术，其中菌群的高分辨信息（包括定性与丰度数据）被分析，见图1～图3。

图1 组间物种差异显著性检验(门水平)

由图1可见，在“门”分类水平上，微生态制剂组与益生菌组、抗生素组相比，厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、无壁菌门（Tenericutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）等代表着样品中大多数菌群，占比95%以上。同时，不同组间各物种的丰度发生了明显的变化。与后两者相比，微生态制剂组中无壁菌门菌群显著地降低(P＜0.05)。

由图2和图3可见，在“属”分类水平上，无论抗生素组、益生菌组和微生态制剂组，随时间变化仔猪菌群结构也在发生着改变。0～35 d，巨型菌属（Megasphaera）、链型杆菌属（Catenibacterium）、葡萄球菌属（Streptococcus）等菌群相对丰度随时间变化显著(P＜0.05)。而乳杆菌属（Lactobacillus）作为优势菌群且相对丰度变化不大，微生态制剂组与益生菌组、抗生素组相比，乳杆菌属的相对丰度有增加趋势。

2.5 微生态制剂对仔猪免疫性能的影响

利用酶联免疫法分析，检测微生态制剂对仔猪血清中热休克蛋白-40（HSP-40）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）等的影响，结果见表4。

由表4可见，18 d时，与抗生素组相比，添加微生态制剂喂养的仔猪血清中IgA和IgM水平均有显著性提高(P＜0.05)。而与益生菌组相比，添加微生态制剂喂养的仔猪血清中HSP-40水平显著提高(P＜0.05)，IgA和IgM水平无显著性改变(P＞0.05)，IgG水平显著降低(P＜0.05)。

3 讨论

图2 组间物种差异显著性检验(属水平)

随着人们生活质量的提高以及全球经济一体化，动物性食品安全已成为一个世界性的挑战和全球重要的公共卫生问题。其中，抗生素残留问题是影响动物性食品安全的重要因素之一。基于对抗生素危害性的认识，“安全、绿色、环保”的新型饲用抗生素替代产品已成为饲料行业的重点发展方向。微生态制剂，作为纯天然绿色产品，符合当今健康养殖模式，迎合人们追求绿色食品的意愿，其推广应用给饲料行业和养殖业带来巨大经济效益，对促进都市型现代农业的发展有重要的现实意义。

我国农业部第1126号公告公布的允许使用的饲料添加剂品种目录（2008）中，饲料级微生物添加剂有16种，屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、粪肠球菌（Enterococcus Faecilius）和乳酸肠球菌（Lactococcus lactis）也都包括在内。屎肠球菌，是人体内原著菌群、同样是饲料工业中广泛使用的乳酸菌菌种之一；其自身的优良性能在饲料添加剂中得以体现：大量的动物实验表明，饲料中加入屎肠球菌，具有促进动物生长、调整肠道菌群结构、抑制有害病原菌生长、减少疾病发生、降低仔猪腹泻率、改善毛色光泽、减少粪臭等优良特性。与此同时，屎肠球菌类产品也存在着其它乳酸菌类似的问题，如菌株的纯化与传代、存储过程中抗逆性差、货架期短、检测方法不统一，导致产品稳定性和益生特性差异大[9-10]。

微胶囊包被是一种用微型密封胶囊包被固态、液态或气态物质，在特定条件影响下以可控速度释放包被内容物的技术。微胶囊技术的优势在于形成微胶囊时，芯材被壁材包覆而与外界环境隔离，它的性质能较好地保留下来，在适当的条件下，壁材被破坏时又能将囊心释放出来。这给使用带来许多方便:①将益生菌通过微囊化转变成一种稳定的细粉颗粒，改变微生态制剂产品的形态，这种微胶囊产品具有良好的流动性和分散性，很容易与其它饲料混合均匀，便于运输、贮存和添加使用。②微生态制剂产品的耐酸性和热稳定性较差，但将其制成微胶囊产品后，由于微胶囊的保护，能够有效地防止菌体失活，提高微生态制剂产品的稳定性。采用肠溶性壁材后，还能防止胃液的破坏，从而使尽可能多的菌体到达肠道，真正起到保健和治疗的作用。③可将配伍禁忌的各种成分在同一产品中隔开。④使不溶于水的物质能均匀地分散在水溶性介质中。因此，微胶囊化有望提高益生菌在生产、贮存和消费过程中的稳定性，生产出耐贮存、耐高温、耐高压、耐酸性的微生态制剂[19-22]。本研究涉及的微囊化颗粒的活菌数为1.0×1011CFU/g，在80℃高温和模拟胃液中活菌存活率分别达到85.0%和90.0%。

图3 肠道菌群组成（属水平）分析

表4 免疫性能分析

泡腾技术系在制剂中加入碳酸盐和有机酸、遇水产生CO2气体而调节释药行为的技术；泡腾片即是依此技术原理制成的片剂。它具有携带使用方便、水中均匀分布、生物利用度高等特点，兼有固态制剂和液态制剂的优点，已广泛应用于药品、食品、保健品等领域，应用前景广阔[12]。益生菌与泡腾技术相结合，可制成适合饮水的片剂；不仅减少了液态益生菌制剂储存要求高、品质不稳定的缺点，还降低了某些固态益生菌制剂加工过程中活菌死亡的风险（如高温高湿环境制粒）。本研究涉及的泡腾颗粒的活菌数为1.0×1010CFU/g，每5 g的发泡量和崩解时限分别为6.5 ml和5 min，崩解后pH值约为6.2，有利于在饲喂动物饮水系统中释放并达到合适的使用浓度。

本研究将两种不同工艺运用到益生菌产品的制备中，制成同时适合日粮与饮水添加的微生态制剂，分析了主要成分含量及性质，再将该制剂按0.1%比例加入到仔猪日粮和饮水中。经过36 d的饲养周期，与抗生素组相比，仔猪的平均日增重和料重比无明显差异（P＞0.05），腹泻率显著降低13.1%(P＜0.05)；粪便中无壁菌门菌群显著地降低(P＜0.05)，乳杆菌属菌群丰度有增加趋势。与抗生素组相比，添加微生态制剂喂养的仔猪血清中IgA和IgM水平均有显著性提高(P＜0.05)。而与益生菌组相比，添加微生态制剂喂养的仔猪血清中HSP-40水平显著提高(P＜0.05)，IgA和IgM水平无显著性改变(P＞0.05)，IgG水平显著降低(P＜0.05)。

4 结论

综上结果可见，该微生态制剂可显著提高仔猪的生长性能、显著降低仔猪腹泻率，显著影响了肠道菌群组成和部分免疫指标。此外，有两个问题需要今后深入研究和对比：①本研究中运用了两种工艺制成复合制剂，但由于条件有限、未对单一工艺产品做动物对照试验，需要进一步探索。②微生态制剂中只使用了一种乳酸菌，而使用其它种乳酸菌的剂量与功效，需要进一步对比和试验。