重症甲型H1N1流感患者核酸检测和特异性抗体检测的诊断价值分析

张群 刘超 李蕾

【摘 要】 目的：探讨重症甲型H1N1流感患者中流感病毒核酸檢测和特异性抗体检测的诊断价值。方法：2016年3月～2018年4月 期间流感实验室收集的40例重症甲型H1N1流感病例血清和鼻咽拭子标本，并采用血凝抑制法和巢式RT-PCR对患者血清中特异抗体及鼻咽拭子中流感病毒RNA进行检测。结果：急性期和恢复期血清效价比较，抗体差异显著。25%患者两种方法检测均表现为阳性，45%患者两种检测方法均表现为单独抗-甲型H1N1阳性，30%患者均表现为单独甲型H1N1RNA阳性；甲型H1N1流感病例血清中特异性抗体，发病时间越长阳性检出率越高，差异具有统计学意义（P<0.05）；核酸检测结果显示，在发病早期更容易检出流感病毒的RNA，差异明显。结论：核酸检测与特异性抗体检测结合使用有助于提高流感病例检测准确性，提高治疗效果。

【关键词】 甲型H1N1流感；流感病毒；特异性抗体；RNA；诊断价值

【中图分类号】 R365 【文献标志码】A 【文章编号】1005-0019（2018）17-044-02

一般流感病毒不同，甲型H1N1流感经禽流感、猪流感、人流感三种病毒重组，属于新型的流感病毒[1]。本文旨在探讨重症甲型H1N1流感患者中甲型H1N1流感病毒RNA和特异性抗体的诊断价值，收集40例重症甲型H1N1流感病毒患者为研究对象，现报告如下：

1 资料与方法

1.1 临床资料 2016年3月～2018年4月期间流感参比实验室收集的40例甲型H1N1流感病例，所有病例均符合《甲型 H1N1流感诊疗方案》诊断标准，男25例，女15例，年龄15～76岁，平均年龄（45.5±4.2）岁，其中14例病例伴随着基础疾病，4例病例为孕产妇。

1.2 检测方法 使用生理盐水对鼻咽拭子进行稀释，再吸取0.5ml放置在无菌管中，保存在-20℃环境中，如有使用需求，需提前30分钟标本放入95℃水中进行灭活，才能提取RNA。静脉血液样本离心2小时内，必须进行血清分离，保存在4℃环境中，并在一周内检测甲型 H1N1流感特异性抗体。检测试剂选用Promgeag公司的AMV Erverse Transcriptase，TaKaRa 宝生物工程（大连）公司的Dntp和Ex Taq DNA聚合酶，上海生物工程有限公司的总RNA提取试剂盒，Sigma公司的受体破坏酶以及长春生物制品研究所的甲型 H1N1流感标准抗原。采用巢式RT-PCR技术对鼻咽拭子样本进行检验，通过A型流感通用物MP1、MP2、ANP1、ANP2及甲型H1N1流感特异性鉴定引物 H1HAP1、H1HAP2鉴定PCR扩增。采取血凝抑制法对血清样本进行检验，使用受体酶按4：1比例加入血清中，将血清样本水浴（37℃）14小时，再放置灭活（56℃）30分钟，配置4个红细胞凝集单位/25ul抗原，将微量板中加入PBS，每个孔25ul，在第一例微量板中加入处理好的血清25ul，按照倍比稀释依次进行添加，最后一个孔空留，加入4个红细胞凝集单位/25ul抗原，并在温室放置20分钟进行孵育，每个孔加入新鲜鸡蛋红细胞悬液（0.75%），再孵育30分钟后观察结果。

1.3 结果判定 甲型H1N1 RNA阳性病例对最后1次阳性进行统计，抗-甲型H1N1阳性病例对最早1次阳性进行统计。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0软件对本次研究数据做统计学分析，以均数±标准差（x±s）表示计量资料；以百分比表示计数资料，P<0.05时提示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲型H1N1流感病毒病例血清检测结果 40例甲型H1N1流感病毒血清样品检测表明，所有抗体>1：320，抗体有效价>1：5120样品19份，特异性抗体阳性，28例，阳性检出率70.00%，急性期和恢复期血清效价比较，抗体差异显著。25%病例两种方法检测均表现为阳性，45%病例两种检测方法均表现为单独抗 -甲型H1N1阳性，30%病例均表现为单独甲型H1N1RNA阳性。

2.2 不同时间阳性检出率分析 甲型H1N1流感病例血清中特异性抗体，发病时间越长阳性检出率越高，差异具有统计学意义（P<0.05）；核酸检测结果显示，在发病早期更容易检出流感病毒的RNA，差异明显，详见表1.

3 讨论

甲型H1N1流感属于急性呼吸道疾病，主要由甲型H1N1流感病毒所致，好发于青少年群体[2]。该疾病具有一定的传染性，且潜伏期较长，主要通过飞沫、体液、分泌物、鼻腔、口腔、眼睛黏膜直接或间接传播。发病后病例出现发热、咽喉疼痛、浑身乏力、酸痛、恶心、呕吐、腹泻、咳嗽咳痰等临床症状，严重者甚至引起肺炎、肺出血、呼吸窘迫综合征、肾功能衰竭等并发症[3]。由于甲型H1N1流感病毒中NP蛋白和M蛋白含量较高，且保守性好，因此，甲型H1N1流感检查时可作为通用引物进行鉴定。而血凝素HA变异性较高，可作为特异性鉴定引物。国外相关资料研究结果表明[4]，HIV感染会破坏患者自身免疫系统，继而感染甲型 H1N1流感病毒，感染7天后对患者采取RT-PCR检测发现，阳性率为29%，且患者体内血清特异性抗体滴度均处于低下水平。如患者在14～30天后RT-PCR检测血清特异性抗体滴度仍处于低下水平时，可能与患者基础疾病所服免疫抑制药物有关。因此，在甲型 H1N1流感诊断过程中，如患者自身免疫力较低，应将隔离期限适当延长，直至核酸检测表现为阴性时方可解除隔离，以免造成疾病传播。

为提高甲型 H1N1流感病毒检验准确率，可将核酸检测和血清传播结合使用，前期采取核酸检测，后期采取血清检测，这种有助于提高临床检验准确性，提高治疗效果。

参考文献

[1] 李玉香，汪杨，鲍万国等.重症甲型 H1N1流感病毒基因与特异性抗体检测的诊断意义[J].中华医院感染学杂志，2016，（12）：2641-2643.

[2] 李玉香，汪杨，高玉伟等.甲型H1N1流感病毒流行病学调查[J].中国免疫学杂志，2016，（8）：1098-1100.

[3] 白志军，吴新伟，伍业建等.广州地区新型甲型H1N1流感患者病毒RNA检出率与病程关系的研究[J].南方医科大学学报，2017，29（11）：2313-2315.

[4] 王文静，何菡，赵秀英等.甲型H1N1流感患者血液与尿液样本病毒核酸检测与分析[J].中华医院感染学杂志，2016，20（6）：805-806.