应用实时荧光定量PCR技术对一例新城疫的诊断报告

樊琼

摘要：新城疫是养禽生产中的常见病、多发病，对鸡群的影响比较大，传统上我们一般通过临床表现和剖检变化对其做出诊断，近年来随着科技的不断发展，实时荧光定量PCR技术也为大家所熟知和掌握，本文就一例采用实时荧光定量PCR技术诊断新城疫的过程进行介绍。

关键词：新城疫；PCR；诊断

新城疫（ND）又称亚洲鸡瘟，主要侵害鸡、火鸡、野禽及观赏鸟类，由鸡新城疫病毒（NDV）引起，死亡率高，对养鸡业危害严重。近日在锦州某一蛋鸡规模场，50日龄的鸡群突然出现呼吸困难，采食量下降，个别出现运动失调等临床症状。对其中3只死亡鸡只进行了剖检，发现眼结膜出血；脾脏萎缩，是正常脾的1/2大小；卵泡变形、出血、菜花样变；腺胃乳头靠近腺胃肌胃相接处出血，肠道滤泡肿胀，肠道黏膜有密集出血斑；盲肠扁桃体萎缩出血；泄殖腔有輕度出血。采集3只病死鸡的组织病料，对同群未发病的2只鸡采集了喉、肛拭子，用于新城疫病原学检测。

1材料与方法

1.1病料

无菌采集新鲜脏器（喉头、气管、心、肝、脾、肺、肾、小肠）各2g并加入5mL PBS（磷酸缓冲溶液）于研磨器中充分研磨，离心取上清液转入无菌离心管中保存备用。喉、肛拭子可以直接用于实验。

1.2主要仪器

Ⅱ级生物安全柜（1300系列A2型，Thermo Scientific）；荧光定量PCR仪（105，美国伯乐）；台式冷冻高速离心机（Sorvall Stratos，Thermo）。

1.3实验方法

按照离心柱式提取法提取核酸，严格按照凯杰生物工程（深圳）有限公司新城疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒的说明书进行操作。加入制备的RNA溶液10uL，反应体系25uL。

2结果

具体结果见图1。从图1中可以看出，病死鸡的3份样品均为阳性，2份健康鸡全为阴性。说明病死鸡患有新城疫。

3小结

3.1实时荧光定量PCR技术的应用现状

随着动物疫病检测技术的不断发展，原有的检测手段已不能满足现代疫病诊断的需要，PCR技术也渐渐脱掉了那层“神秘的面纱”，尤其是近几年来基层兽医队伍不断地发展、壮大，从业人员业务素质也在逐年提高，原来的“高精尖”的诊断技术逐步走进了日常的检测工作中。PCR技术具有高度的灵敏性、特异性和精确性，而且快速、高效、灵活、易于操作，尤其是实时荧光定量PCR技术与常规PCR相比具有特异性更强、自动化程度更高等优点，目前已得到广泛应用。

3.2实时荧光定量PCR的结果判定

参照凯杰生物工程（深圳）有限公司新城疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒的说明书对检测结果进行判定。

3.2.1质控标准阴性对照CT值应等于none；阳性对照CT值应小于等于28.0。

3.2_2结果判断读取数据时基准线调至与阴性对照重合，阴性CT值为none，阳性CT值为16.89，实验结果有效。图1中3、4、5样本对应的CT值分别为17.62、18.53、19.17，判定为阳性；7、8样本对应的CT值均为none，判定为阴性。