单核苷酸多态性结合位点C19007T与宫颈癌患者易感性的相关研究

秦 梅，武红权，厉 勇，杨 旭，胡苑苑

(1.贵州省贵阳市第一人民医院输血科 550002；2.贵州省人民医院检验科，贵阳 550002；3.贵州省贵阳市妇幼保健院输血科 550003)

宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，在女性恶性肿瘤发病率中排第3位。近年来，宫颈癌的发病趋于年轻化[1]，广大女性的健康及生命安全受到了严重威胁。通过对宫颈癌相关易感因素的研究表明，遗传基因的突变很有可能是引起宫颈癌的一个重大因素[2]。到目前为止，针对宫颈癌易感性与基因多态性的研究已有较大进展[3-4]。本研究旨在通过探讨位于caspase-3基因C19007T位点的多态性与宫颈癌易感性的关系，为宫颈癌的病因学研究提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取从2013年2月至2016年9月于贵州省人民医院、贵阳市妇幼保健院、贵阳市第一人民医院妇科住院的100例宫颈癌患者(观察组)，均未曾在采血前行放疗、化疗、免疫治疗等其他针对肿瘤的治疗，平均年龄为(46.0±10.1)岁，经术后的宫颈活组织病理检查结果判定，所有患者肿瘤病理类型都是宫颈鳞状细胞癌。根据国际妇产科联盟(FIGO)的2009年临床分期标准：Ⅰ、Ⅱ期有60例，Ⅲ、Ⅳ期有40例；局部的淋巴结转移情况：32例有转移，68例无转移。患者各项信息(年龄、吸烟状态、孕产次、HPV感染情况等)均来源于病历记录。选取同期于该院体检未检出宫颈病变的100例健康女性作为对照组，平均年龄为(47.8±9.4)岁。所有研究对象间相互均无直系亲属关系，且均无遗传病病史。

1.2 方法

1.2.1DNA的提取 采集所有受试者晨起空腹时的静脉血3～5 mL，运用TIANamp试剂盒提取所采血液中基因组DNA，于-80 ℃保存。

1.2.2基因分型 选取caspase-3上3′-UTR端的microRNA结合位点C19007T，使用PCR-PIRA方法进行引物设计，于多态性位点的上游用碱基A代替T，进而引入TaqⅠ酶切位点。其中，上游的引物为：5′-TTG TGA AAA AGT TAA ACA TTG AAG TAT-3′，下游的引物：5′-TTC AGG ACA AAC ATC ACA AA-3′，扩增的产物片断长度是230 bp(图1)。PCR扩增反应体系的总体积为25 μL，包括10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 17.15 μL，dNTP 0.5 μL，MgCl22.5 μL，P 10.3 μL，rTaq酶0.25 μL，P2 0.3 μL。PCR扩增条件：95 ℃条件下预变性10 min，95 ℃条件下变性45 s，退火45 s，72 ℃ 50 s，扩增35个循环，72 ℃ 7 min，4 ℃保存，反应结束。电泳槽中放入2%琼脂糖凝胶，并加11 μL PCR反应产物后电泳(30 min)。在凝胶成像仪下成像、拍照。酶切反应体系为15 μL，包括ddH2O 1.5 μL，XspI 1 μL(8 U/μL)，Buffer(10×K)1.5 μL及PCR反应产物11 μL。在37℃恒温水浴箱过夜。用3.5%的琼脂糖凝胶电泳(30 min)后观察并记录酶切结果，见图2。

图1 caspase-3基因的PCR产物

图2 caspase-3基因的C19007T多态性的分析

1.2.3免疫组织化学 从观察组中选取100例宫颈鳞癌组织的石蜡标本。标本来源于贵州省人民医院、贵阳市妇幼保健院病理科。常规石蜡包埋，4 μm连续切片后，给予免疫组织化学染色，显微镜下观察。结果分析：以细胞质或细胞膜中出现棕黄色颗粒为caspase-3蛋白的阳性表达。当物镜下的阳性细胞，≤10%记0分；>10%～50%记1分；>50%～75%记2分；>75%记3分。染色强度的区分标准：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。上述两项的得分相加以后：0分为“-”，1～2分为“+”，3～4分为“++”，5～6分为“+++”。

1.3 统计学处理

所有数据采用SPSS19.0软件进行处理，计数资料采用率表示，组间采用χ2检验或Fisher确切概率法，等级资料的相关性分析采用Spearman等级相关分析，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 caspase-3基因上C19007T 位点多态性的基因分布情况

对照组与观察组在年龄、吸烟状况、婚次、产次方面均无明显差异。而HPV感染在观察组84例(84%)的分布频率明显高于对照组24例(24%)且有统计学意义(P<0.01)。

2.2 caspase-3结合位点上C19007T 的基因型分布及其与宫颈鳞状细胞癌遗传易感性的关系

所有研究对象的C19007T 多态位点共计有3种基因型：C/C、T/C及T/T，其在观察组中的基因型频率依次为58%、37%、5%，在对照组中依次为55%、29%、16%，将基因型T/C、T/T分别与等位基因C/C作对比，两组间基因型C/C和T/C的分布频率差异无统计学意义(P=0.540)，C/C、T/T基因分布频率差异有统计学意义(P=0.020)，见表1。T/T基因型较C/C基因型可更明显降低宫颈鳞状细胞癌发病的可能性，见表2。经χ2检验，caspase-3 rs1049216多态位点在两组中均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3 caspase-3上3′-UTR端microRNA结合位点的SNP与宫颈鳞状细胞癌转移的关系

有淋巴转移组的caspase-3 C19007T 的C/C、T/C、T/T基因型频率分别为31.0%、35.1%、20.0%，无转移组的分别为69.0%、64.9%、80.0%，分别将基因型T/C、T/T与基因型C/C作对比，两组基因型的分布频率均差异无统计学意义(P=0.678、0.606)，见表3。

表1 C19007T SNP基因型在观察组和对照组的分布(n)

表2 C19007T 基因型和宫颈癌临床分期的关系[n(%)]

表3 C19007T 基因型与淋巴转移的关系[n(%)]

A:正常宫颈组织；B:C/C基因型患者的瘤组织；C：T/C基因型患者的瘤组织；D：T/T基因型患者的瘤组织

表4 3种基因型的宫颈癌组织中的caspase-3蛋白表达水平[n(%)]

2.4 免疫组织化学

癌组织中caspase-3蛋白的表达减少，免疫组织化学染色结果提示：阳性颗粒位于肿瘤细胞的细胞质中，部分间质细胞内亦有所发现。以上研究结果表明，caspase-3蛋白的表达情况与rs1049216的基因型类型(C/T、C/C、T/T)没有显著的关联(P=0.903)，见表4、图3。

3 讨 论

在女性所有的生殖系统肿瘤中，宫颈鳞状细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一。目前，宫颈鳞状细胞癌的致命性在全球引起广泛关注，在发展中国家的进展速度更为引人注目[5]。宫颈鳞状细胞癌的发生、发展是个多因素参与的复杂过程，随着近年来的深入研究，众多研究表明，遗传因素的改变是引起宫颈鳞状细胞癌出现易感性的重要原因。遗传易感性虽然不能直接引起肿瘤，但会使肿瘤发生的可能性增加，而其中的SNP及其相关组合，可增加复杂性遗传病的发病风险[6]。有研究表明，microRNA结合位点的SNP可明显改变生物合成和/或相应的microRNA的功能表达，并由此增加恶性肿瘤的患病风险[7]。同时，有大量研究表明，基因3′-UTR的SNP功能位点可大大增加恶性肿瘤发生的可能性[8-9]。

caspase-3是一种与细胞凋亡有关的蛋白，caspase-3在整个细胞凋亡过程中发挥着关键作用[10]。有研究表明，caspase-3在宫颈鳞状细胞癌中表达减低，使得癌细胞在向周围正常组织及全身各器官的扩散转移速度加快。有文献报道，caspase-3基因的多态性与许多种恶性肿瘤易感性有关[11-12]。本研究显示，在caspase-3基因中的结合位点C19007T 的T/T基因型可导致宫颈癌的发生。与HPV感染和宫颈鳞状细胞癌的临床分期都有显著的相关性。相关研究表明，SNP的很多位点与多种肿瘤的转移与预后有关[13-14]。

细胞增殖与凋亡失衡、促细胞凋亡的蛋白表达减少均会诱发肿瘤，而caspase-3在细胞的凋亡中极为重要。相关研究表明，caspase-3在很多妇科恶性肿瘤中的表达出现变化[15]。但caspase-3在宫颈鳞状细胞癌细胞中的表达可能与C19007T 位点的多态性无明显相关性。

总之，caspase-3基因3′端非翻译区microRNA结合位点的C19007T 可能与宫颈癌的淋巴转移无关，同时，caspase-3的蛋白表达情况与rs1049216的多态性无明显相关性。这些发现可用于对易感人群进行宫颈鳞状细胞癌的筛查，对宫颈鳞状细胞癌的预防及治疗具有重要意义。