肝泡型包虫病患者体液免疫变化的研究*

马 婕,冀林华,刘文静,崔 森△,樊海宁▲

(1.青海大学附属医院,西宁 810001;2.青海大学医学院高原医学研究中心,西宁 810001)

包虫病是常见的人畜共患病，是由棘球绦虫幼虫-棘球蚴寄生而致的，又称棘球蚴病。引起人感染的主要是细粒棘球蚴和多房棘球蚴，又分别称为囊型(cystic echinococcosis，CE)和泡型包虫病(alveolar echinococcosis，AE)[1-2]。人体在感染棘球蚴过程中宿主-寄生虫之间的相互作用关系十分复杂[3]。目前对棘球蚴与宿主的免疫反应有许多研究结果，但大多集中在细胞免疫方面，而对体液免疫的研究还比较少。寄生虫在宿主体内生长离不开体液免疫的调节，B细胞作为机体体液免疫的重要细胞，通过提呈抗原、产生抗体以及分泌细胞因子实现其价值[4-5]。本文通过研究肝泡型包虫病(HAE)患者外周血B淋巴细胞部分表面抗原的表达及所分泌的抗体水平变化，探讨HAE患者体液免疫的变化情况。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取30例2015年12月至2016年12月在青海大学附属医院影像中心初步诊断但未治疗的HAE患者(HAE组)，男17例，女13例，平均年龄41.5岁(18～69岁)，回顾手术后确诊为HAE患者。排除标准[6]：(1)感染性疾病(细菌、病毒等)；(2)恶性肿瘤；(3)风湿免疫性疾病患者；(4)合并囊型包虫病及其他寄生虫疾病患者；(5)应用非甾体类抗炎药、激素类药物、精神病治疗药物等。同时选取30例本院体检的健康人为正常对照组，其中男16例，女14例，平均年龄42.5岁(19～65岁)，行血常规、肝肾功能、心电图及B超等检查示均正常。本研究经青海大学附属医院伦理委员会批准，抽血及化验均征得受试者同意并签署知情同意书。

1.2试验方法

1.2.1仪器与试剂 流式抗体CD19-FITC、CD20-PE均购自美国BD公司，10×红细胞裂解液购自中国联科生物公司，IgG、IgM、IgA均购自美国Thermo Fisher公司，流式细胞购自艾森生物公司，蛋白分析仪购自德国西门子公司，纯水制备系统购自美国Millipore公司，电子天平购自美国Bio-Rad公司，涡旋混合仪购自美国Scientific Industries公司。标记笔、采血管、试管、各种规格的移液器及枪头等。

1.2.2主要溶液配制方法 (1)1×红细胞裂解液：用纯水900 mL溶解100 mL 10×红细胞裂解液，4 ℃保存备用。(2)PBS溶液：将PBS粉末缓冲体系充分溶于超纯水，配制成1×PBS缓冲液，4 ℃保存备用。

1.2.3流式细胞仪检测B淋巴细胞抗原表达 取100 μL EDTA抗凝全血加入流式细胞分析专用试管，加入10 μL CD19-FITC、10 μL CD20-PE后混匀，室温避光反应15 min，再加入1 mL红细胞裂解液，室温避光反应10 min后，离心弃上清液，加入2 mL 1×PBS洗涤1次后以300 μL PBS重悬细胞，用艾森生物ACEA NovoCyteTM流式细胞仪进行FCM测定，在FSC/SSC图上设门去除碎片及死细胞，然后测定CD19+、CD20+B淋巴细胞的百分率，用NovoExpress软件获取、分析数据。

1.2.4检测IgG、IgM、IgA 抽取外周血2～3 mL于含纤维蛋白酶促凝剂的管中(橘黄色管盖)，应用西门子BNⅡ全自动特定蛋白分析仪检测IgG、IgM、IgA的表达水平。

2 结 果

2.1两组外周血B淋巴细胞的比率 HAE组患者外周血CD19+B淋巴细胞比率为(2.18±0.82)%，正常对照组为(9.26±3.40)%，二者比较HAE组显著低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。 CD20+B淋巴细胞比率为(2.88±1.05)%，正常对照组为(4.54±1.26)%，二者比较HAE组显著低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1、2。

A：设门于淋巴细胞；B：HAE患者外周血CD19+B淋巴细胞比率；C：HAE患者外周血CD20+细胞B淋巴比率

A：设门于淋巴细胞；B：正常对照组外周血CD19+B淋巴细胞比率；C：正常对照组外周血CD20+B淋巴细胞比率

2.2HAE组与正常对照组免疫球蛋白水平比较 HAE组IgG为(23.99±7.08)g/L，IgA为(3.23±1.68)g/L，正常对照组IgG为(11.13±2.30)g/L，IgA为(2.14±1.02)g/L，二组相比HAE组IgG、IgA水平均明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而HAE组IgM为(1.26±0.36)g/L，正常对照组为(1.78±0.80)g/L，二者相比HAE组IgM水平低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 HAE组与正常对照组免疫球蛋白水平比较

3 讨 论

包虫病被认为是一种世界性公共卫生问题，在我国以新疆、内蒙古、青海等畜牧业发达地区多发，严重影响当地的经济发展及居民健康[7]。包虫病在人类的传播过程中，人作为中间宿主，误食了被狗或狐狸等宿主的粪便排出的寄生虫卵污染的蔬菜或水源，虫卵在人小肠内孵化并钻入肠壁，随血流到达肝、肺、脑等脏器并寄生，其中以在肝脏内寄生最为多见，称为HEA，在青海地区HEA较其他地区多见[8]。

在人体被泡球蚴感染后寄生虫长期在宿主体内寄生，能刺激宿主免疫系统发生特殊的变化，棘球绦虫长期寄生于宿主体内，为了抵抗宿主免疫系统的杀伤，包虫能引起宿主免疫系统发生一系列免疫反应，宿主和包虫的免疫系统都做出了相应调整才能达到动态平衡的“共生”状态。在泡球蚴感染的早期，为了避免自身遭受伤害，宿主通过体内免疫细胞的增殖及分化使淋巴细胞转化功能增强，有排除异己、控制泡球蚴早期生长和转移的作用；而随着病程的进展，淋巴细胞转化功能有所下降，宿主的免疫反应受抑制，泡球蚴在体内长期寄生并发育[9]。

既往的研究中，细胞因子如白细胞介素(IL)-2、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(INF-γ)等在肝包虫病免疫中的作用得到阐明，这些细胞因子对肝包虫病的发病机制及对疾病的严重程度、疗效及预后有重要意义[10]。目前还没有发现关于人体感染包虫后抗体反应的结论性信息，包虫感染能引起人体外周血循环中IgG、IgM、IgA和IgE的变化，有学者指出肝包虫病患者免疫球蛋白水平变化结合超声影像学表现，对后续诊断及治疗工作有一定的帮助[11]。

本试验对HAE患者的体液免疫进行了研究，比较了HEA患者外周血成熟B细胞变化及血清IgG、IgA、IgM等抗体的水平与健康人的区别。以CD19+、CD20+标记外周血成熟B细胞，用流式细胞仪测定外周血中CD19+、CD20+表达量，结果表明HAE患者CD19+、CD20+阳性率明显低于正常对照组，说明泡球蚴在体内寄生过程中，淋巴细胞比例下降，宿主的免疫反应处于抑制状态，使得泡球蚴能在宿主内长期寄生并发育。

寄生虫侵入宿主机体后首先表现IgM上升，IgM是一种大分子抗体，相对分子质量最大，故称之为巨球蛋白，IgM能清除血流中的原虫颗粒，为一种凝集性抗体，是直接、间接凝集实验的诊断要素。张永红等[12]在小鼠腹腔接种棘球蚴原头节后，在未发育形成囊泡前30 d能测到低效价的IgM血清抗体，90 d后随着囊泡不断长大，IgM开始降低。本研究中HAE患者血清IgM抗体较正常对照组降低，考虑包虫在宿主体内长期寄生，宿主的免疫抑制，导致IgM下降。

继IgM后，IgG水平明显升高，IgG是一种保护性抗体，在免疫过程中占主导地位，可与相应抗原发生特异性结合，中和虫体毒素，对虫体起杀伤作用。寄生于不同组织器官的包虫诱导宿主产生抗体的类型也不同，表现为肝包虫的主要是IgG抗体，肺包虫主要是IgM抗体[13]。IgG包括4种不同类型，分别为IgG1～4，既往研究表明随着疾病进展，IgG1和IgG3水平逐渐降低，而IgG2和IgG4在整个疾病过程中均保持着类似的高度[14]。IgA存在两种形式——血清型IgA和分泌性IgA，血清型IgA具有抗虫体毒素的作用；分泌性IgA在保护机体胃肠道、呼吸道等黏膜免疫器官受虫体入侵时起到关键作用。GUO等[15]研究发现IL-6能促进IgA的分泌，而近年来研究资料表明，肝包虫病患者血清IL-6水平较健康人明显升高，可能是倒导致IgA水平增高的原因之一。

在本研究中HAE患者血清IgM抗体较正常对照组降低，而IgG和IgA则较正常对照组明显升高，考虑包虫在宿主体内长期寄生的过程中刺激机体产生强弱不等的免疫应答反应，随着包虫囊增大和包虫寄生数量的增多，抗体阳性率也随之变化[16]。在人体感染包虫后发生的免疫反应与疾病的性质和特点相关，这个特性提供了一个重要的优势，使得免疫系统针对特定群体的传染病病原体能够调整其防御策略。

目前，尽管HAE进展的分子机制尚不明确，但有大量基础研究结果显示体液免疫及细胞免疫参与其进展。HAE的免疫相当复杂，只有清楚地了解了其免疫机制，才能更有效地寻找抑制包虫感染的办法，从而控制其传播。