肺结核患者外周血MAIT细胞功能及血清IL-22水平分析*

冯 龙，马 燕，叶子瑜，颜慧敏，林碧华，林东子,，袁耀钦，李玉美，黄明元，周克元，曾今诚△

(1.广东医科大学广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞 523808；2.广东医科大学东莞市医学活性分子开发与转化重点实验室，广东东莞 523808；3.广东省东莞市第六人民医院检验科 523008)

肺结核(TB)是由结核菌感染引发的肺部传染性疾病，严重威胁人类健康。TB在我国发病率较高，据统计2013年我国新发感染TB患者900万，其中死亡约150万[1]。因此，我国是世界上结核疫情最严重的国家之一，控制TB发展和传播是疾病防控的一大挑战[2]。流行病学研究显示，5%～10%结核菌感染者最终发展成TB，在这个过程中，宿主固有免疫和适应性免疫在控制结核菌活动过程中起重要作用[3]。

MAIT细胞是一类新的天然免疫T细胞。人MAIT细胞的T细胞受体由恒定的Vα7.2-Jα33链及有限的β链组成。绝大部分MAIT均表达CD8和CD161抗原，本文亦将CD8+CD161+T细胞视为MAIT细胞[4]。此类细胞因其嗜组织性，倾向于分布在肠道黏膜固有层而得名[4]，目前发现约20%肝脏T细胞，5%左右外周血T细胞均为MAIT细胞，而在肺部其含量也有较丰富[5]。近年来研究发现MAIT细胞在启动自身免疫活化、分泌炎性反应细胞因子、杀伤病原微生物中起着重要作用[6]。亦有研究报道小鼠MAIT细胞可以抵抗脓肿分枝杆菌的感染，缺乏这些细胞的小鼠更容易受到细菌和脓肿分支杆菌的感染[7]。尽管越来越多的证据表明T细胞在肺部免疫反应中的重要性，但对结核菌感染过程中MAIT细胞的调节机制知之甚少，尤其是MAIT细胞功能与多种细胞因子异常表达密切相关。IL-22在屏障组织(包括肠道、皮肤和肺)防御微生物感染过程中起关键作用[8]。最近亦有研究发现MAIT细胞存在于女性生殖器黏膜中，并且在细菌感染后，产生IL-17和IL-22[9]。然而，IL-22产生的MAIT细胞在结核菌感染过程中的作用国内外均未见明确报道。本研究通过检测肺结核患者外周血MAIT细胞功能及血清IL-22水平，探讨MAIT细胞及IL-22在抗结核免疫过程中的作用及意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2016年1月至2017年5月在东莞市第六人民医院(东莞市结核病定点治疗医院，原东莞市慢性病防治医院)就诊且参照《WS 288-2008肺结核诊断标准》确诊的初治TB患者50例，男30例，女20例，年龄20～65岁，平均(38.2±1.8)岁。所有TB患者均行常规抗结核治疗，其中常规抗结核治疗前(治疗3 d以内)27例，常规抗结核治疗后(治疗28～35 d)23例；痰涂片检查结核菌阳性患者20例，阴性患者30例。选取与TB患者同期的健康志愿者30例为对照组，排除心、肝、肾等疾病，男20例，女10例，年龄23～58岁，平均(38.9±1.7)岁。TB患者排除标准：(1)患有严重肝肾疾病、心脏病和其他病情严重的疾病；(2)妊娠期和哺乳期妇女；(3)酗酒和吸烟严重；(4)有使用镇静类或其他精神类药物；(5)合并感染艾滋病或者其他传染病和其他(如糖尿病、肿瘤等)慢性疾病；(6)近期服用免疫调节剂或者激素治疗；(7)不签署知情同意书的患者。收集标本前均取得标本提供者知情同意并签署知情同意书，本研究经东莞市第六人民医院和广东医科大学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1流式细胞术检测MAIT细胞水平 所有对象均用肝素钠管空腹采血5 mL，D-Hanks液稀释后置于淋巴细胞分离液上。1 500 r/min离心20 min后将单个核细胞吸出、洗涤，加入CD3抗体、CD8抗体和CD161抗体室温避光染色30 min，PBS洗涤2次，BD-FACS Calibur流式细胞分析仪检测CD8+CD161+T细胞亚群水平。采用Flow Jo 7.6.1软件对流式细胞仪检测结果进行分析。

1.2.2ELISA检测血清IL-22水平 采用ELISA法检测血清IL-22水平，Human IL-22 ELISA检测试剂盒为美国BioLegend公司产品，操作步骤严格按照说明书进行，检测仪器为芬兰MK3-酶标仪。

1.2.3磁珠分选 采用MojoSortTMHuman CD8 T Cell Isolation Kit(BioLegend公司)分选外周血CD8+T细胞，具体步骤严格按照说明书进行。

1.2.4抗原刺激 采用结核菌抗原Ag85B刺激实验检测TB患者和健康志愿者外周血CD8+CD161+T细胞产生IL-22、Perforin的能力。将以上分离的外周血单个核细胞(3×105个)采用Ag85B(10 μg/mL)刺激，同时加入CD28(1 μg/mL)和CD49d(1 μg/mL)共刺激分子。37 ℃ 5%CO2培养箱刺激6 h，PBS洗涤，分别加入CD3抗体、CD8抗体和CD161抗体室温避光染色30 min，采用胞内因子染色试剂盒(达科为生物技术股份有限公司)对IL-22、Perforin抗体进行胞内染色，具体操作步骤严格按照说明书进行。以上实验设立对照组，对照组仅采用CD28(1 μg/mL)和CD49d(1 μg/mL)刺激。

2 结 果

2.1TB患者外周血MAIT细胞水平 TB患者外周血MAIT细胞水平[(3.15±2.21)%]明显低于健康志愿者[(5.31±2.28)%]，差异有统计学意义(t=3.661,P<0.05)。痰涂片检查结核菌阳性TB患者外周血MAIT细胞水平[(1.87±2.11)%]明显低于阴性TB患者[(4.43±2.27)%]，差异有统计学意义(t=4.016,P<0.05)。常规化疗药物治疗前TB患者外周血MAIT细胞水平[(2.04±2.19)%]明显低于治疗后TB患者[(4.26±2.23)%]，差异有统计学意义(t=3.543,P<0.05)。TB患者外周血MAIT细胞水平与患者性别、年龄均无关(P>0.05)。

2.2TB患者外周血血清IL-22水平 TB患者外周血血清IL-22水平(32.67±35.17)pg/mL明显低于健康志愿者(55.18±30.14)pg/mL，差异有统计学意义(t=2.919,P<0.05)。痰涂片检查结核菌阳性TB患者外周血血清IL-22水平(19.55±36.68)pg/mL明显低于阴性TB患者(45.79±34.16)pg/mL，差异有统计学意义(t=2.584,P<0.05)。常规化疗药物治疗前TB患者外周血血清IL-22水平(22.37±34.11)pg/mL明显低于治疗后TB患者(42.97±36.41)pg/mL，差异有统计学意义(t=2.063,P<0.05)。TB患者外周血血清IL-22水平与患者性别、年龄均无关(P>0.05)。

2.3MAIT细胞和IL-22水平相关性分析 Pearson相关分析结果显示TB患者外周血MAIT细胞和IL-22水平呈正相关 (r=0.427,P<0.05)，见图1。

图1 MAIT细胞和IL-22水平相关性分析

2.4MAIT细胞产生细胞因子的能力分析 Ag85B刺激后TB患者和健康志愿者外周血MAIT细胞产生Perforin的能力与对照组比较均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2A、B。Ag85B刺激后TB患者和健康志愿者外周血MAIT细胞产生IL-22水平无明显差异(P>0.05)，见图2C。

A：代表性流式图；B：两组Perforin水平比较；C：两组IL-22水平比较

3 讨 论

MAIT细胞是一群在进化上高度保守的T淋巴细胞，在外周血中MAIT细胞占总T细胞的 1%～10%，由于其可以激活表达Granzyme B、Perforin、IFN-γ、TNF-α等杀伤性细胞因子，从而构成了固有免疫屏障的重要防线。近年来研究发现MAIT细胞在抵抗各种细菌感染中均发挥着重要的作用，例如肺炎克雷伯菌、痢疾志贺菌、土拉菌、卡介苗、和脓肿分支杆菌等[10-12]。大肠杆菌感染外周血单个核细胞后，MAIT细胞产生的IFN-γ、TNF-α均明显低于对照组[13]。本研究发现TB患者外周血MAIT细胞水平明显低于健康志愿者(P<0.05)，尤其是痰涂片检查结核菌阳性患者外周血MAIT细胞水平较阴性患者更低(P<0.05)。另外，TB患者经常规化疗药物治疗后MAIT细胞水平明显增高(P<0.05)，以上结果提示结核菌感染可能弱化了MAIT细胞功能，机体MAIT细胞减少可能促进了TB的发生、发展。此外，在这个过程中，本文亦发现TB患者外周血IL-22水平亦明显下降，并与患者结核菌活跃度密切相关。特别是，Pearson相关分析结果显示TB患者外周血MAIT细胞水平和IL-22水平呈明显正相关(P<0.05)，提示二者关系密切，可能共同介导了TB的发生、发展。为了进一步验证结核菌感染是否直接影响MAIT细胞功能，本文采用结核菌抗原Ag85B刺激分选的CD8+T细胞，并采用流式细胞术检测MAIT细胞产生Perforin和IL-22的能力，结果发现Ag85B刺激之后TB患者和健康志愿者外周血MAIT细胞产生Perforin的能力与对照组比较明显降低(P<0.05)，提示TB患者MAIT细胞激活杀伤性细胞因子的能力可能受损。

IL-22是在2000年发现的细胞因子，在机体中由Th22、Th17、Th1、NK22、γδT及MAIT等细胞分泌[14-15]，它在自身免疫性疾病、慢性炎症性疾病和感染性疾病中发挥着重要作用，在银屑病、异位性皮炎和溃疡性结肠炎患者中作用更加突出[16]。IL-22是T细胞膜表面成熟的细胞因子，其阳性细胞可通过产生效应分子，发挥抗结核菌作用，抑制T细胞IL-22表达，巨噬细胞抗结核作用将会被抑制。本研究发现Ag85B刺激后，TB患者和健康志愿者外周血MAIT细胞产生IL-22水平无明显差异(P>0.05)，提示结核菌抗原可能通过完全不同的机制调节了MAIT细胞Perforin和IL-22表达，然而确切的机制还有待进一步研究。

综上所述本文作出以下推测：(1)TB患者MAIT细胞水平降低，尤其与患者结核菌活跃状态密切相关。(2)当机体感染结核菌后，MAIT细胞功能受到明显影响，尤其是产生Perforin的能力明显降低。(3)MAIT和IL-22在抗肺结核免疫过程中可能起着协同作用。因此，MAIT细胞和IL-22动态变化可反映肺结核的病情发展与转归，具有成为肺结核患者临床诊断依据的可能。尽管MAIT细胞和IL-22在结核病的发生、发展中可能具有一定的作用，但在抗结核免疫中各亚群细胞与IL-22的协同机制尚不明确，仍需进一步研究。