循环肿瘤细胞对卵巢癌的诊断价值

张秀琳， 洪煜婧， 赵枰,*， 陈相， 周峰， 鲁晓燕

(1. 南通市第一人民医院检验科， 江苏 南通 226001； 2. 南通大学公共卫生学院, 江苏 南通 226001； 3. 南通市第一人民医院妇产科， 江苏 南通 226001)

近年来卵巢癌发病率不断上升，且有年轻化的趋势，是妇科病死率最高的恶性肿瘤。由于疾病早期缺乏典型的临床症状，患者就诊时多为晚期，虽经术后的联合化疗，但复发率仍很高，预后差[1-2]。糖类抗原125(CA125)是目前临床用来诊断卵巢癌的主要肿瘤标志物，但对早期卵巢癌诊断的特异度和敏感度均不高，尤其是假阳性率较高。因此，如何提高早期卵巢癌的检出率和诊断效率，是目前面临的主要挑战。1869年，Ashworth等[3-4]首次提出循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)的概念，被誉为“实时肿瘤活检”。本研究采用免疫磁珠为基础的负性富集结合流式细胞技术，对卵巢癌、卵巢良性肿瘤及健康妇女外周血CTCs进行定量检测，评价CTCs在卵巢癌诊断中的价值。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选择2015年6月至2016年8月本院收治经病理确诊的卵巢癌患者65例，年龄41～71岁, 病理分期：按国际妇产科联盟(FIGO，2014)的分期标准，Ⅰ期9例，Ⅱ期3例，Ⅲ期38例，Ⅳ期15例；同期卵巢良性肿瘤患者21例(囊腺瘤12、子宫内膜异位症4例、巧克力囊肿3例、纤维瘤2例)；健康体检者10例，年龄42～68岁，无恶性肿瘤史。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 术前静脉穿刺抽血2 mL于无添加剂的干燥真空管中，Cobas e 601电化学发光免疫分析仪及原装进口配套试剂(德国罗氏公司)检测血清CA125浓度；7.5 mL于EDTA抗凝管中，24 h内进行下列检测。

1.2.2 CTCs富集 Ficoll淋巴细胞分离液(上海朗顿生物科技有限公司)提取单个核细胞，加入少许红细胞裂解液溶解混有的红细胞，所得细胞与Miltenyi磁珠(德国Miltenyi Biotech公司)混合，加入已润湿的LD柱中，在强磁场作用下收集未吸附的细胞组份(含CTCs)，LH750全自动血细胞分析仪(美国Beckman Coulter公司)计数、重悬。

1.2.3 流式细胞术检测上皮细胞黏附分子(EpCAM)阳性的CTCs 单个核细胞悬液经固定、并加入透膜剂后，测定管加单克隆抗体CD45-APC、EpCAM-FITC(德国Miltenyi Biotech公司)，对照管加同型对照，避光孵育，PBS液洗涤，加入多聚甲醛，混匀、流式细胞仪(美国BD公司)检测。每例样本检测(1～2)×104个细胞，重复3次，用BD AccuriTMC6软件(1.0.264.21)进行数据采集和分析。以CD45-/EpCAM+细胞为CTCs，结果以外周血每106单个核细胞中EpCAM阳性细胞数表示外周血中的肿瘤细胞含量，即CTC单位为×10-6。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，以受试者工作特征(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)评估外周血CTCs检测对卵巢癌的诊断效能。

2 结果

2.1 ROC曲线评估外周血CTCs检测对卵巢癌的诊断效能

以术后病理诊断为“金标准”，以卵巢癌65例为疾病组，以健康体检者10例及卵巢良性肿瘤患者21例为对照组(合计31例)，ROC曲线分析显示，外周血CTCs检测诊断卵巢癌的AUC为0.806(95%CI：0.722～0.890)，最佳临界值为4.5(>4)个，敏感度为55.4%，特异度为96.8%，阳性预测值为97.3%(图1)。同样以术后病理诊断为“金标准”，以早期卵巢癌(Ⅰ/Ⅱ期)12例为疾病组，以健康体检者10例及卵巢良性肿瘤患者21例为对照组(合计31例)，应用ROC曲线分析，外周血CTCs检测诊断卵巢癌的AUC为0.679(95%CI：0.473～0.884)，最佳临界值为5.5(>5)个，敏感度为41.7%，特异度为100%，阳性预测值为100%(图2)。

图1 采用外周血CTCs区分卵巢癌患者和对照者的ROC曲线

图2 采用外周血CTCs区分早期卵巢癌(Ⅰ/Ⅱ期)患者和对照者的ROC曲线

2.2 血清CA125检测对卵巢癌的诊断效能

以术后病理诊断为“金标准”，血清CA125水平的正常参考值为<35 U/mL，≥35 U/mL判为阳性，即诊断为恶性，各组病例血清CA125浓度见图3。其诊断早期卵巢癌(Ⅰ/Ⅱ期)和卵巢癌的阳性预测值分别为61.5%和91.9%。

图3 卵巢良性肿瘤和各期卵巢癌患者血清CA125浓度

3 讨论

CTCs是指因诊疗操作或自发地从原发灶或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，一般认为与肿瘤的转移、复发密切相关。目前美国食品和药物管理局(FDA)已经通过了对CellSearch系统的审核，应用于乳腺癌等患者外周血CTCs的检测[5]。随后一些学者应用该系统进行了多种恶性肿瘤的研究，结果表明CTCs对肿瘤早期筛查、转移、复发监测、疗效评价和预后判断都具有特定的临床应用价值[6-7]。但外周血中CTCs的含量极低，常规方法难以检测。检验技术的不断发展，使得分离、富集稀有CTCs成为可能[8]。

本研究首先采用密度梯度离心和红细胞裂解的方法提取外周血中的单个核细胞，然后用负性富集的方法去除单个核细胞中的绝大部分CD45+白细胞；接着用流式细胞术检测荧光标记的抗EpCAM特异性抗体以确定EpCAM+的细胞，认为CD45-/EpCAM+的细胞即为CTCs。国外有研究表明，用EpCAM作为标志可以在卵巢癌患者中确认CTCs并有较高的特异性[9]。我们的结果显示，外周血中CTCs的含量对诊断早期卵巢癌(Ⅰ/Ⅱ期)和卵巢癌特异度均较高，可作为一种液体活检以提高对卵巢癌的诊断效率。与CA125相比，CTCs诊断早期卵巢癌(Ⅰ/Ⅱ期)和卵巢癌的阳性预测值均较高，可见CTCs检测对早期卵巢癌表现出很好的诊断价值，但不可否认CA125在灵敏度方面表现更优，这与Michael等[10]的研究结果一致。总之，CTCs检测在诊断卵巢癌方面具有较高的特异性和更好的阳性预测值，可用于卵巢癌的诊断。