细胞角蛋白18-M65/M30诊断非酒精性脂肪性肝病的价值研究

罗东凤 叶一农 劳小荣

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是21世纪全球重要的公共健康问题之一。目前肝组织活检是诊断非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的金标准, 但因其存在侵入性, 在临床上难以广泛开展, 故寻找合适的无创诊断方法具有重要意义。本研究通过分析NAFLD患者血清细胞角蛋白18(Cytokeratin18,CK18)-M65和CK18-M30水平, 探讨其无创诊断NAFLD的价值。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月～2017年12月在本院经肝活组织检查证实的21例成年(≥18周岁)NAFL或者NASH患者作为脂肪肝组, 选取同期本院体检中心体检的23例健康人作为正常对照组。排除标准［1］：每周饮酒量＞140 g(男性)或70 g(女性)；其他可导致肝脂肪变的疾病, 如病毒性肝炎、药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性及自身免疫性肝病；肝移植患者；合并终末期疾病或恶性肿瘤；FibroScan检测失败；拒绝签署知情同意书。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 检测方法 对所有研究对象的身高、体质量, 高血压、糖尿病及酒精消耗史等进行记录。BMI=体质量/身高2(kg/m2)。肝活组织检查前1 d抽空腹静脉血, 完成肝脏生物化学指标、血糖、血脂等测定(日本日立7180型全自动生化分析仪)。CK-18检测采用M65及M30定量检测酶联免疫吸附试剂盒(苏州和锐医药科技有限公司, 批号HR0320171001、HR0220170901)。

1.2.2 肝脏病理学检查 采用美国巴德18G穿刺针在超声引导下完成经皮肝穿刺, 获取约1.5～2.0 cm肝组织。穿刺肝组织迅速置入中性甲醛溶液固定, 并进行脱水, 石蜡包埋,切片并进行 苏木精(HE)、胶原纤维(Masson)及网状纤维染色。由2名有经验的病理专家进行组织学独立评分, 不得参考患者信息, 当评分出现不一致时, 则需达成共识。参照《美国国立卫生研究院NASH临床研究网病理工作组指南》［2］进行活动度评分(NAS)和纤维化分期。

1.2.3 FibroScan测定 使用FibroScan-502机型(法国Echosens公司)M型探头完成LSM及肝脏CAP测定。探头频率固定在3.5 MHz, 结果分别以kPa及dB/m表示。由获得FibroScan操作者证书的医生定人定机操作。患者空腹, 取仰卧位, 右手置于大脑后面, 以最大限度扩展肋间隙, 检测区域选择右侧腋前线至腋中线第7、第8、第9肋间隙。选择与肝活组织检查相同部位检测。每例研究对象成功检测LSM在10次以上, 所有测量值的四分位间距(IQR)与中位数的比值(IQR/med)＜30%并且成功率(成功率检测次数/总检测次数)≥60%为有效测量。未符合要求视为失败。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计分析。各组数据均进行正态性检验(Shapiro-Wilk法), 若符合正态分布, 计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验；若不符合正态分布, 计量资料以M(P25, P75)表示, 采用非参数检验(Mann-Whitney U检验), CK18-M65、CK18-M30不符合正态分布, 取10的对数来分析, 计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验和Fisher精确概率法；相关性检验采用Spearman等级相关分析法, P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 脂肪肝组与正常对照组各指标比较 两组CK18-M65对数、CK18-M30对数、CAP、LSM、BMI、ALT、AST、TCH、UA、GLU、GGT比较, 差异均有统计学意义(P＜0.05)。两组年龄、性别、TBIL、ALB比较, 差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 21例NAFLD患者中ALT正常组与ALT升高组各指标比较 21例NAFLD患者中, ALT升高的患者作为升高组,ALT正常的患者作为ALT正常组。两组血清CK18-M30、ALT、AST、GGT比较, 差异均有统计学意义(P＜0.05)。两组年龄、性别、BMI、CAP、LSM、CK18-M65对数、TBIL、ALB、TCH、UA、GLU比较, 差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表1 NAFLD患者与健康人各指标比较(n, ±s)

表1 NAFLD患者与健康人各指标比较(n, ±s)

注：与正常对照组比较, aP＜0.05, bP＞0.05

指标 脂肪肝组(n=21) 正常对照组(n=23) t/χ2/u P性别 (男 /女 ) 15/6b 13/10 1.054 0.305年龄(岁) 40.05±16.80b 41.70±7.10 0.417 0.669 BMI(kg/m2) 30.96±5.38a 21.47±1.59 8.089 0.000 CAP(dB/m) 331.97±29.82a 202.96±33.41 13.462 0.000 CK18-M65对数(ng/L) 2.82±0.39a 2.31±0.26 5.146 0.000 CK18-M30对数(ng/L) 2.21±0.53a 1.70±0.54 3.157 0.003 TBIL(μmol/L) 13.60±6.08b 13.05±5.73 0.309 0.760 ALB(g/L) 43.93±3.75b 42.48±2.01 1.618 0.113 TCH(mmol/L) 5.01±0.63a 4.50±0.91 2.177 0.035 UA(µmol/L) 450.43±136.71a 369.30±91.16 2.335 0.024 GLU(mmol/L) 5.76±1.66a 4.78±0.39 2.752 0.009 LSM(kPa) (9.6, 15.4)a (3.4, 5.4) 15.0 0.000 ALT(U/L) (30, 101)a (11, 29) 48.5 0.000 AST(U/L) (22, 47)a (16, 26) 94.5 0.001 GGT(U/L) (31, 100)a (20, 37) 116.5 0.003

表2 21例NAFLD患者中ALT正常组与ALT升高组各指标比较(n, ±s)

表2 21例NAFLD患者中ALT正常组与ALT升高组各指标比较(n, ±s)

注：与ALT升高组比较, aP＜0.05, bP＞0.05

指标 ALT正常组(n=9) ALT升高组(n=12) t/χ2/u P性别 (男 /女 ) 5/4b 11/1 3.697 0.055年龄(岁) 47.00±14.53b 34.83±17.04 1.297 0.210 BMI(kg/m2) 28.51±3.93b 32.80±5.73 1.926 0.069 CAP(dB/m) 322.93±36.19b 338.75±23.39 1.217 0.238 CK18-M65对数(ng/L) 2.73±0.42b 2.89±0.36 0.939 0.360 CK18-M30对数(ng/L) 1.88±0.54a 2.45±0.38 2.845 0.010 TBIL(μmol/L) 14.44±5.64b 12.96±6.56 0.542 0.594 ALB(g/L) 44.27±3.94b 43.69±3.76 0.343 0.736 TCH(mmol/L) 4.70±0.93b 5.40±0.93 1.707 0.104 UA(µmol/L) 392.56±136.89b 493.83±124.73 1.767 0.093 GLU(mmol/L) 5.29±0.99b 6.11±1.99 1.131 0.272 LSM(kPa) (8.4, 15.0)b (9.6, 17.5) 49.000 0.754 ALT(U/L) (25, 401)a (64, 186) 0.000 0.000 AST(U/L) (17, 32)a (34, 70) 15.500 0.004 GGT(U/L) (18, 53)a (42, 115) 17.000 0.007

2.3 ALT正常的脂肪肝组与正常对照组CK18、LSM、CAP的比较 两组CK18-M65对数、CAP、LSM比较, 差异有统计学意义(P＜0.05)。两组CK18-M30对数比较, 差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 ALT正常脂肪肝组与正常对照组CK18、LSM、CAP比较( ±s)

表3 ALT正常脂肪肝组与正常对照组CK18、LSM、CAP比较( ±s)

注：与正常对照组比较, aP＜0.05, bP＞0.05

指标 ALT正常脂肪肝组(n=9) 正常对照组(n=23) t P LSM(kPa) 12.60±4.44a 4.36±1.01 8.667 0.000 CAP(dB/m) 322.93±36.20a 202.96±33.41 11.433 0.000 CK18-M65对数(ng/L) 2.73±0.42a 2.31±0.26 4.027 0.000 CK18-M30对数(ng/L) 1.88±0.54b 1.70±0.54 1.104 0.276

2.4 CK18-M65、CK18-30与LSM、CAP的相关性比较 所有研究对象的CK18-M65对数与CAP(r=0.533, P=0.000＜0.05)、LSM(r=0.441, P=0.003＜0.05)具有相关性 , CK18-M30对数与CAP(r=0.302, P=0.056＞0.05)、LSM(r=0.255, P=0.095＞0.05)无 相关性。

3 讨论

CK18是构成肝细胞中间丝蛋白的主要成分之一, 其主要功能是维持肝细胞正常结构, 保护其免受机械和非机械的损伤。当肝细胞凋亡发生时, 蛋白酶被活化并开始裂解细胞内的不同底物, 包括CK18。目前, 相关研究认为肝细胞凋亡在NAFLD进展过程中具有重要作用, 肝细胞凋亡的程度与NASH炎症分级及纤维化分期呈显著正相关［3］。Wieckowska等［4］发现NAFLD患者血清CK18水平明显升高, 且CK18水平与肝纤维化分期呈正相关。而且研究发现在肥胖患者以及儿童中, 可依据CK18水平诊断NASH［5］。Feldstein等［6］在一项CK18诊断NASH价值的多中心验证性研究中, 证明M65和M30可作为预测NASH的独立危险因素。我国学者研究汉族和维吾尔族NASH与CK18片段的相关性, 结果CK18-M30和CK18-M65在健康人、单纯性脂肪肝和NASH患者血清中的水平依次升高［7,8］, 提示CK18片段可用于NASH的筛查。本研究结果也显示, 脂肪肝组血清CK18-M65、CK18-M30水平显著高于正常对照组, 差异有统计学意义(P＜0.05)。因本研究病理组样本量较少, 尤其是单纯性脂肪肝的缺乏, 未能进一步分析CK18-M65、CK18-M30与不同肝组织病理学变化的相关性。基于瞬时弹性B超是目前无创评估肝内脂肪病变程度及肝纤维化程度的一种很好的方法, 本研究中, 所有研究对象的CK18-M65对数与CAP(r=0.533, P=0.000＜0.05)、LSM(r=0.441, P=0.003＜0.05) 具有相关性 , CK18-M30 对数与 CAP(r=0.302, P=0.056＞0.05)、LSM(r=0.255, P=0.095＞0.05)无相关性。证明CK18-M65可以反映肝内脂肪病变程度及纤维化程度。同时, 本研究还发现ALT正常的脂肪肝组与正常对照组CK18-M65对数、CAP、LSM比较, 差异有统计学意义(P＜0.05)。说明在ALT正常的NAFLD中CK18-M65也能显示肝脏损伤, 因此CK18-M65比ALT更能反映NAFLD患者的肝脏损伤。而且有研究表明约30%NASH患者ALT水平是正常的。这结果也与本研究结果一致。

综上所述, 血清CK18-M65、CK18-M30水平在诊断NAFLD中具有较高的临床价值, 为CK18-M65、CK18-M30无创诊断NAFLD尤其是NASH提供了依据。但由于病理样本量的局限, 还需在接下来的临床工作中进行更大样本量的研究。