癃畅颗粒对大鼠前列腺增生组织Caspase-3基因表达的影响

赵 猛，安立文，郑 雪，杨珊珊，孙一诺

良性前列腺增生症（benign prostatic hyperplasia,BPH）是老年男性泌尿系统的常见病、多发病，随着年龄的增高，其发病率不断增加。BPH以尿频尿急、排尿困难、淋漓不尽、夜尿增多，甚者尿潴留为主要临床表现，进一步发展可导致肾功能不全，严重尿路感染等并发症，严重影响患者的生活质量。随着分子生物学技术的发展，目前对BPH发病机制的研究已深入到多种信号通路的分子机制层面，但具体的作用机制仍不明确。很多研究表明，BPH的发生与细胞凋亡相关调控基因的表达密切相关[1]。BPH的治疗方法很多，各有利弊，近年来中医药在BPH的治疗上积累的丰富的经验，其疗效确切、不良反应少，患者心理压力小，具有广阔的开发前景及较高的学术研究价值[2-3]。癃畅颗粒是我院临床应用多年的经验方，治疗BPH临床疗效确切，为给该方药治疗BPH提供更充分确切的理论依据，本研究拟通过观察其对细胞凋亡相关基因Caspase-3表达的影响，进一步探讨癃畅颗粒治疗BPH的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar雄性大鼠120只，体质量（250±20）g,大鼠饲养环境温度（18±2）℃，湿度（30±10）%，常规饲养，自由摄食、饮水，专用鼠饲料由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号为黑动字第P00305007号。Wistar大鼠由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号为黑动字第P00102004号。

1.2 药物 癃畅颗粒由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室生产，主要成分为：炙黄芪20 g，党参15 g，牛膝15 g，山萸肉15 g，山甲10 g，皂刺15 g和瞿麦10 g等；丙酸睾酮注射液为上海通用药业股份有限公司生产，批准文号：沪卫字(1995)第009001号；癃闭舒胶囊为石家庄科迪药业有限公司生产，批准文号：国药准字021203024。

1.3 主要试剂 兔抗人Caspase-3多克隆抗体够于美国Sigma公司，PV-9000二步法试剂盒、DAB显色试剂盒、TUNEL细胞凋亡试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 造模与分组 将大鼠普通饲养1周观察无异后，随机选取20只作正常对照组，其余100只参照参考文献[4]方法造模。100只大鼠腹腔注射0.2%戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉，经阴囊无菌手术摘除双侧睾丸，结扎残端以确保止血，缝合皮肤。待大鼠苏醒后，随机数字表分法分为五组：模型组、癃闭舒组、癃畅颗粒低剂量组、癃畅颗粒中剂量组、癃畅颗粒高剂量组，每组20只。术后当天，除正常组外所有大鼠均经皮下注射丙酸睾酮50 mg/kg，隔日一次，连续28 d。

1.5 给药剂量及方法[5]造模后，开始灌胃给药，癃闭舒组剂量为4.42 g·kg-1·d-1（相当于临床剂量等效剂量的20倍），癃畅颗粒低、中、高3个组给予剂量依次为3.33 g·kg-1·d-1（相当于临床量的10倍）、5.00 g·kg-1·d-1（相当于临床量的15倍）和6.67 g·kg-1·d-1（相当于临床量的20倍），连续给药，正常组和模型组每日灌胃给等量生理盐水1次。

1.6 取材与制样 各大鼠分别在给药后第30 d时处死，摘除前列腺组织，分组标记。经10%甲醛溶液固定，常规脱水透明，浸蜡包埋，切片。

1.7 TUNEL法检测前列腺组织细胞凋亡 将石蜡切片常规脱蜡水化，采用TUNEL细胞凋亡试剂盒，严格按照说明书进行操作，光镜下观察，胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，即凋亡细胞。每组在高倍镜下（×400）观察20张切片，每张切片随机选取5个视野，观察视野内全部细胞，计算凋亡指数（AI=凋亡细胞/细胞总数×100%）。

1.8 Caspase-3免疫组化检测 采用免疫组化PV二步法，每组20张石蜡切片常规脱蜡至水；3%H2O2孵育10 min灭活内源性过氧化酶；微波修复抗原：将切片浸入0.01 mol/L枸椽酸盐缓冲液（pH 6.0）中，放置在微波炉中加热5 min×2次，间隔10 min，冷却至室温；0.1 mol/L PBS洗涤，3 min×3次；滴加适当比例稀释的一抗（1:200兔抗人Caspase-3多克隆抗体），37 ℃孵育2 h；PBS洗3 min ×3次；滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体，37 ℃孵育20 min；PBS洗3 min×3次；DAB室温避光显色，苏木素复染，逐级乙醇脱水、透明、中性树胶封片，显微镜观察。用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知的Caspase-3阳性切片（北京中杉金桥生物技术有限公司提供）作为阳性对照。每张切片均检测5个视野（×400），胞质和/或胞核着色棕黄色为阳性。所有步骤严格按照说明书执行。

1.9 统计学处理 应用SPSS 16.0统计软件，结果用（）表示，采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，P＜0.05差异有显著性。

2 结果

2.1 各组间大鼠前列腺组织细胞凋亡指数的比较 与正常组比较，模型组大鼠前列腺组织细胞凋亡指数明显降低，差异显著（P＜0.01），表明BPH大鼠前列腺组织细胞凋亡指数显著降低。与模型组比较，癃闭舒组和癃畅颗粒各剂量组大鼠细胞凋亡指数均有不同程度升高，差异显著（P＜0.01），表明癃畅颗粒能够促进BPH大鼠前列腺组织细胞凋亡。癃畅颗粒高剂量组与癃闭舒组比较差异不显著（P＞0.05）；癃畅颗粒中、低剂量组与癃闭舒组及癃畅颗粒高剂量组比较均差异显著（P＜0.01），癃闭舒组及癃畅颗粒高剂量组细胞凋亡指数显著高于癃畅颗粒中、低剂量组；癃畅颗粒中、低剂量组间比较差异显著（P＜0.01），中剂量组细胞凋亡指数显著高于低剂量组；表明癃畅颗粒有明显促进前列腺组织细胞凋亡的作用，高剂量组优于中、低剂量组，中剂量组优于低剂量组，高剂量组作用与癃闭舒组作用相当。结果见表1。

表1 各组大鼠前列腺组织细胞凋亡指数的比较（n=20,）

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP ＜0.01

组别视野（个） 凋亡指数（%）正常组 100 84.04±5.83模型组 100 5.97±0.62a癃闭舒组 100 81.43±6.40b癃畅颗粒低剂量组 100 25.46±3.97a、b癃畅颗粒中剂量组 100 46.50±3.56a、b癃畅颗粒高剂量组 100 81.20±7.66b

2.2 各组大鼠前列腺组织Caspase-3表达百分率的比较 与正常组比较，模型组大鼠前列腺组织Caspase-3表达百分率明显降低，差异显著（P＜0.01）；表明BPH大鼠前列腺组织Caspase-3表达百分率显著下降。与模型组比较，癃闭舒组和癃畅颗粒各剂量组大鼠Caspase-3表达百分率均不同程度升高，差异显著（P＜0.01），表明癃畅颗粒能够上调Caspase-3的表达；癃畅颗粒高剂量组与癃闭舒组比较无显著差异（P＞0.05）；癃畅颗粒中、低剂量组与癃闭舒组及癃畅颗粒高剂量组比较均差异显著（P＜0.01），癃闭舒组及癃畅颗粒高剂量组Caspase-3的表达显著高于癃畅颗粒中、低剂量组；癃畅颗粒中、低剂量组间比较差异显著（P＜0.01），中剂量组Caspase-3的表达显著高于低剂量组；表明癃畅颗粒可以通过上调Caspase-3的表达促进细胞凋亡，高剂量组优于中、低剂量组，中剂量组优于低剂量组，高剂量组作用与癃闭舒组作用相当。结果见表2。

3 讨论

表2 各组大鼠前列腺细胞Caspase-3基因表达百分率的比较（n=20,）

表2 各组大鼠前列腺细胞Caspase-3基因表达百分率的比较（n=20,）

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

组别 Caspase-3基因表达百分率正常组 29±1.89模型组 16±1.46a癃闭舒组 92±1.67a、b癃畅颗粒低剂量组 71±2.51a、b癃畅颗粒中剂量组 80±1.91a、b癃畅颗粒高剂量组 93±2.10a、b

BPH是老年常见病及多发病，随着我国人口的老龄化，BPH的例数逐年增加，严重影响老年人的生活质量，目前对其发病机制的研究已深入到多种信号通路的分子机制层面。大量研究发现，正常前列腺的大小能保持恒定主要原因是因为腺体内细胞的增值与凋亡保持平衡的结果，细胞增殖与凋亡异常是发生BPH的重要原因之一[6]。BPH发生发展过程中，细胞增殖与细胞凋亡同时发生，表现为平滑肌细胞增殖增加和基质细胞凋亡减少。细胞增殖和凋亡失衡作为BPH发病基础，特别是细胞凋亡的减少，受到越来越多的关注[7-8]。细胞凋亡是一个受基因调控的细胞自主的有序的死亡过程，其发生涉及多种生物分子，包括Caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白和p53蛋白、Survivin等。Caspase家族蛋白分3大类：凋亡启动因子、凋亡执行因子和炎症介导因子。研究发现，与 Caspase家族蛋白相关的凋亡激活途径有3种，即始于细胞表面死亡受体的外源性途径、始于线粒体的内源性途径以及与内质网相关的细胞凋亡途径。 Caspase-3被称为杀手蛋白[9]，是Caspase家族蛋白中最重要的凋亡执行者之一，在介导细胞凋亡过程中起着关键作用，是细胞凋亡过程中的主要效应因子。Caspase-3位于级联反应的下游，当其被位于上游且活化的凋亡启动因子Caspas8、Caspase-9和Caspase-10激活时，即标志着细胞凋亡进入不可逆阶段[10-11]。总之，Caspase-3在介导细胞凋亡中其重要作用，随着对Caspase-3的研究不断深入，为BHP药物开发提供了更多选择。

BPH属中医“癃闭”、“淋证”范畴，病因病机为年老肾虚，膀胱气化失常，不能分清泌浊，久则湿热、瘀血、败精阻于下焦水道。属本虚标实，病位在膀胱、精室，由肾所主，与肝、脾及三焦等脏腑密切相关，治宜补肾填精、化瘀通络、清热利湿通淋。癃畅颗粒是我院泌尿外科经验方，全方由黄芪、党参、山萸肉、穿山甲、皂角刺、土茯苓、瞿麦等8味药物组成。方中炙黄芪、党参、山萸肉补肾益气，穿山甲、牛膝、皂刺化瘀通络、活血消8癥，土茯苓、瞿麦利湿通淋，川牛膝引血下行，引导诸药直达病所，诸药合用，切中病机。中药现代药理研究显示，黄芪、党参、穿山甲、皂角刺等药物对多种凋亡调控基因的表达都有调控作用[12-15]。经临床证实疗效确切，能有效缩小前列腺体积，有较好的减轻BPH病人排尿异常症状，改善尿流率参数的作用[16]。在我们以前的基础研究中，相关研究[8,17]等发现，癃畅颗粒能通过下调大鼠前列腺bcl-2基因和上调大鼠前列腺bax基因表达，促进前列腺细胞凋亡，有效缩小模型大鼠的前列腺湿重，减轻病理变化,明显抑制前列腺腺体和前列腺上皮细胞的增生。

本实验中，癃畅颗粒能够明显促进BPH大鼠前列腺组织细胞的凋亡，增加Caspase-3蛋白的表达，高剂量组疗效优于中、低剂量组，癃畅高组作用与癃闭舒组疗效相当。实验中，模型组大鼠前列腺组织Caspase-3蛋白的表达较正常组明显降低，说明Caspase-3基因是前列腺增生症的重要调控基因。

综上所述，癃畅颗粒可以上调BPH模型大鼠Caspase-3的表达，促进细胞凋亡，尤以高剂量组最为明显，这可能是其治疗BPH的作用机制。