种植体周围炎龈沟液中MMP—8和MMP—13表达水平的研究

朱白雪 戴晓玮 高晓蔚

[摘要]目的：探讨基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）-8和基质金属蛋白酶-13（MMP-13）的表达与种植体周围炎的关系，评价其可否作为种植体周围炎诊断的客观指标。方法：使用吸潮纸尖提取40例健康种植体周围龈沟液样本，40例种植体周围炎龈沟液样本，分别记录其探诊出血指数（Sulcular bleeding index，SBI），探诊深度（Probing depth，PD），并拍摄X线片测量种植体周围牙槽骨丧失（Bone loss，BL）情况。使用ProcartaPlexTM多因子分析技术进行细胞因子定量检测并分析。结果：种植体周围炎组SBI和PD值均高于健康种植体组，差异有统计学意义（P<0.05）。种植体周围炎组GCF中MMP-8含量均高于健康种植体组，差异有统计学意义（P<0.05）；但MMP-13在种植体周围炎组和健康组龈沟液中的含量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。MMP-8含量与SBI、PD和BL正相关关系。结论：种植体周围炎龈沟液中MMP-8表达水平升高，与临床种植体周围指标有一定的相关性，可作为种植体周围炎早期诊断和治疗的辅助指标。

[关键词]种植体周围炎；MMP-8；MMP-13；龈沟液；生物标记物；临床指标

[中图分类号]R780.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）09-0126-04

Expression of MMP-8 and MMP-13 in Gingival Crevicular Fluid of Peri-implantitis

ZHU Bai-xue1，DAI Xiao-wei2，GAO Xiao-wei1

（1.Department of Stomatology，the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，Xinjiang，China；

2.Planting Center，Urumqi Stomatological Hospital，Urumqi 830000，Xinjiang，China）

Abstract： Objective To investigate the relationship between matrix metalloproteinase-8 （MMP-8） and matrix metalloproteinase-13 （MMP-13） expression and peri-implantitis， and evaluate whether it can be used as an objective indicator for early diagnosis of peri-implantitis. Methods 40 cases of gingival crevicular fluid around healthy implants and 40 cases of peri-implantitis gingival crevicular fluid samples were extracted with moisture absorbing papertips. The sulcus bleeding index， probing depth and X-ray were recorded.Quantitative detection and analysis of MMP-8 and MMP-13 by ProcartaPlexTM multifactor analysis. Results The values of SBI and PD in the peri-implantitis group were higher than those in the healthy implant group， the differences were statistically significant（P<0.05）. The content of MMP-8 in GCF of peri-implantitis group was higher than that of the healthy implant group（P<0.05）. However， there was no significant difference in the content of MMP-13 in the gingival crevicular fluid between the peri-implantitis group and the healthy implant group（P>0.05）. Existence of positive correlation between MMP-8 and SBI、PD and BL. Conclusion Increased expression of MMP-8 in gingival crevicular fluid has a certain correlation with clinical indicators of implants， and can be used as an auxiliary indicator for early diagnosis and treatment of peri implant inflammation.

Key words： peri-implantitis； MMP-8； MMP-13； gingival crevicular fluid； biomarkers； clinical indicators

種植体周围炎是种植修复远期失败的主要原因之一[1-2]。据报道其发病率为18%～35%[3-4]。近十年的分子生物学及免疫学研究发现，种植体周围炎患者龈沟液中的细胞因子含量变化与该病的发生、发展密切相关，可作为种植体周围炎早期诊断和治疗的重要指标[5]。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）是免疫应答过程中产生的一类重要的蛋白溶解酶，负责组织降解和再生蛋白，通过水解肽链裂解蛋白的同时能够通过激活其自身活性从而增强细胞因子、趋化因子和生长因子的蛋白质水解和炎性反应过程，在结缔组织和骨组织的破坏吸收过程中起重要作用。与牙周炎，龋病，颌骨囊肿，恶性肿瘤等组织破坏性疾病密切相关[6-8]。MMP-8是龈沟液中的主要胶原酶，由多核细胞释放，然而近年来一些研究表明非多核细胞，如软骨细胞，内皮细胞，成牙本质细胞等亦可产生MMP-8，与细胞外基质Ⅰ型胶原的降解密切相关[9]。MMP-13在种植体周围炎的发生发展过程中起着重要作用，其含量在一定程度上反映了种植体周围炎的演变过程，另外它在刺激破骨细胞活力方面的特性使其有望能够在已发生骨吸收的界面重新形成骨结合方面有所贡献[10-11]。本研究主要检测MMP-8、MMP-13在健康种植体和炎症种植体龈沟液中的表达水平的差异，判断其与探诊深度（Probing depth，PD）、龈沟出血指数（Sulcular bleeding index，SBI）和牙槽骨丧失（Bone loss，BL）的相关性，为诊断和治疗种植体周围炎提供依据。

1 资料和方法

1.1 研究对象：按照纳入及排除标准选择2016年12月-2017年12月就诊于乌鲁木齐市口腔医院的种植修复患者80例（80颗）。通过伦理审查后，根据种植体周围情况分为种植体周围炎组（40颗）和健康种植体组（40颗）。

1.1.1 纳入标准：①年齡20～60岁者；②种植体型号为瑞士Straumann种植体系统者；③种植义齿行驶功能1年以上者；④种植义齿修复类型不限。种植体周围炎组需根据美国牙周病学的指导方针，符合以下标准中1个以上者可诊断为种植体周围炎：种植体周围龈组织或黏膜充血、肿胀、溢脓；种植体周袋>3mm或有骨袋形成；种植体松动度≥Ⅰ度；X线检查有轻～中度水平的骨吸收或伴个别垂直吸收，骨组织的丧失在种植体的第一个螺纹以下。健康种植体组：种植体周围黏膜正常；种植体周围无牙槽骨吸收；PD≤3mm，SBI<2。

1.1.2 排除标准：①全身系统性疾病者；②接受过种植体周围炎治疗者；③近3个月使用过抗生素及非甾体类药物者；④过高咬合者。

1.2 研究方法

1.2.1 临床指标检测：探诊深度：用牙周探针沿牙齿长轴方向轻轻探到袋底或龈沟底，需特别注意探诊压力控制在20～25N，取最深处记录牙周袋深度。

龈沟出血指数评分标准：0=牙龈健康探针无出血；1=探诊出血，龈乳头及边缘无水肿及颜色改变；2=探诊出血，龈乳头及边缘有颜色改变，无水肿；3=探诊出血，龈乳头及边缘有颜色改变，轻度水肿；4=探诊出血，龈乳头及边缘有颜色改变，明显水肿；5=探诊出血，有自发出血和颜色改变及水肿。

1.2.2 X片检测：采用平行投照法拍摄X线片，并与种植体初始片比较，测量种植体周围牙槽骨吸收量。

1.2.3 龈沟液（Gingival crevicular fluid，GCF）提取：棉卷隔湿、干燥牙面，将40#吸潮纸尖（天津加发医疗器械公司）插入龈沟底部，30s后取出，若纸尖带血则弃去重新采集，将浸湿部分剪入冻存管中，每颗种植体重复取样6次，分别位于种植体的颊侧近中、中央、远中，舌侧近中、中央、远中，每一样本皆含4根吸潮纸尖，-70oC冷冻保存。

1.2.4 MMP-8和MMP-13含量测定：取出ProcartaPlex试剂盒（杭州联科生物公司）提供的标准品，2 000xg离心10s，加入250μl的1X样品缓冲液，于其余7个试管中加入150μl样品缓冲液，从溶解的标准品中取出50μl放入2试管中，上下吹打10次摇匀，尽量避免气泡产生，从管2中吸取50μl放入管3中，摇匀，依次转移，完成标准品的梯度稀释。室温下解冻标本20min，4℃离心（1 000r/min）10min取上清液，在96孔ProcartaPlex多因子检测试剂盒的每孔加入50μl微球混合液；静置3min，倒置去除孔板中的液体；每孔加入150洗液洗涤，重复3次；30μl的Universal Assay Buffer+20μl的标准品或样本；孔板封膜，室温振荡孵育2h；去除封膜，将96孔板置于磁性分离板上，静置3min，倒置去除孔板中的液体；每孔加入150洗液洗涤，重复3次；每孔加入25μl生物素标记的检测抗体；孔板封膜，室温振荡孵育30min；去除封膜，将96孔板置于磁性分离板上，静置3min，倒置去除孔板中的液体；每孔加入150洗液洗涤，重复3次；每孔加入50μl Streptavidin-PE；孔板封膜，室温振荡孵育30min；去除封膜，将96孔板置于磁性分离板上，静置3min，倒置去除孔板中的液体；每孔加入150洗液洗涤，重复3次；每孔加入100μl Reading Buffer；室温振荡5min使微球悬浮后上机检测MMP-8和MMP-13含量。

1.3 统计学分析：应用SPSS 22.0软件统计分析结果，MMP-8、MMP-13及PD符合正态分布采用独立样本t检验，MMP-8和MMP-13的含量与种植体临床指标的相关分析采用相关性检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较：本次共80例患者，每组40例（40颗），两组年龄、性别及种植部位比较，差异无统计学意义（P>0.05）；但种植体周围炎组的PD、SBI及BL均高于健康种植体组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 两组龈沟液中MMP-8及MMP-13含量比较：种植体周围炎组龈沟液中的MMP-8含量明显高于健康种植体组，差异有统计学意义（P<0.05）；种植体周围炎组龈沟液中MMP-13含量高于健康种植体组，但差异不具有统计学意义（P=0.149）。见表2，数据分布情况见图1。临床指标PD、SBI和BL与MMP-8表达均呈正相关，差异有统计学意义（P<0.05），但相关程度密切性较低，见表3。

2.3 MMP-8含量对种植体周围炎的诊断能力：种植体周围炎龈沟液中MMP-8含量诊断种植体周围炎的灵敏度为0.65，特异度为0.68，比值比为3.86（95%CI：1.53～9.75，P=0.004）。

3 讨论

种植体周围炎是一种由于细菌聚集和机体免疫反应所引起的种植体周围软、硬组织的慢性进展性炎症反应。目前临床常规应用的诊断方法如临床检查和X线诊断只能够诊断疾病发生后的严重程度，无法对疾病的整个活动过程进行预测和判断。龈沟液是通过沟内上皮和结合上皮从牙龈结缔组织渗入到龈沟内的液体，其成分与该部位的炎症程度密切相关[12]。学者们已经就龈沟液中生物标记物的表达水平对牙周和种植体周围疾病的预测和诊断做了大量研究，希望通过对种植体龈沟液内生物标记物的检测提升对疾病早期诊断的能力，能够在出现不可逆的骨吸收之前采取相应的治疗措施[13]。

Christoph等提取了504颗种植体及493颗邻近天然牙的龈沟液，ELISA定量检测MMP-8等基质金属蛋白酶的含量，结果显示超过90%的位点可检测到MMP-8，且种植体龈沟液中MMP-8与邻近牙齿MMP-8的含量存在中等程度的相关性，与临床指标PD、SBI和BL的也存在一定的相关性，但相关性均较差，与本研究结果一致[14-15]。Costajunior等分别提取健康种植体患者和存在早期种植体失败患者的口腔黏膜，PCR测定其MMP-8基因型，结果显示病例组MMP-8基因T/T型占63.75%，C/T型占25%，而对照组C/T型占48%，T/T型占38%，存在统计学差异，说明MMP-8基因型为T/T时，已经形成了骨结合的种植体发生失败的危险性较大。综上所述，MMP-8在种植体周围炎的发生发展过程中起到了很重要的作用，可以作为一个早期预防和辅助诊断种植体周围炎的重要依据之一[16]。许多研究表明，牙周炎患者龈沟液中MMP-13的含量明显增加，龈沟上皮和牙龈成纤维细胞中均有发现，但MMP-13在种植体周围炎龈沟液中的表达水平存在一定的争议，MMP-13在种植体周围炎中的作用机制有待进一步研究[11，17]。李德超等在对28颗健康种植体、12颗炎症种植体和40颗健康天然牙龈沟液中MMP-13的表达水平检测过程中发现，健康种植体组与种植体周围炎组的MMP-13表达存在明显的统计学差异，但健康种植体与健康天然牙之间没有区别，且MMP-13的含量与PD、SBI的相关系数均大于0.8。而在本研究中种植体周围炎组MMP-13的含量高于健康种植体组，但差异并不具有统计学意义[10]。这种研究结果的差异可能是因为样本量差异造成的。Marco等在种植钉植入6个月后分别提取了纯钛组和氧化锆组愈合帽周围牙龈组织，免疫组化检测MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9和MMP-13的表达水平，结果显示只有MMP-8的含量在两组中具有统计学差异，而牙龈的术后重建与恢复效果，纯钛组优于氧化锆组，说明种植体周围软组织的恢复与重建可能与MMP-8的表达水平密切相关[11]。

本研究采用的是以Luminex为平台的ProcartaPlex检测技术定量检测MMP-8和MMP-13的表达水平，采用不同荧光强度的荧光染料标记微球，根据与标记了抗体的微球在样本中结合抗原的质量定量检测标记物，该方法与常规ELISA檢测方法相比，对取样的要求较低，即使样本沾染血液，对实验结果不会存在较大的影响[18-19]。

4 结论

MMP-8的表达水平与种植体周围炎的发生发展密切相关，与探针出血、探诊深度和牙槽骨吸收水平存在一定的相关性。可以将MMP-8同其他生物标记物一起联合诊断作为早期诊断和预防种植体周围炎的辅助依据，提升种植体周围炎的早期诊断治疗的能力，而对MMP-13的研究有待进一步探索。

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[收稿日期]2018-06-01 [修回日期]2018-07-16

編辑/朱婉蓉