艾滋病合并结核病患者结核分枝杆菌耐药基因突变特征分析*

谢 祺，张 米，雷素云，高 丽，张桂仙，杨海花，董兴齐

(云南省传染病专科医院检验科，昆明 650301)

全球人类免疫缺陷病毒合并结核分枝杆菌(HIV/MTB)感染的病例逐年增多，每年增幅近10%[1]。2016年全世界1 040万新发结核病患者中估计有103万(9.9%)为HIV感染者，其中死于HIV相关结核病的人数达37.4万。在HIV感染者中结核病控制面临的最大问题是无法准确、快速地诊断出结核病患者[2]。故HIV/MTB感染给艾滋病及结核病的预防和治疗带来了巨大的挑战，也成为全球极其紧迫的公共卫生问题。耐多药结核病发现和治疗危机仍然严重，2016年共新发1 040万结核病，其中新发耐多药结核病病例估计有49万，其中只有近13万登记接受诊疗；2013年，全球耐多药结核病治疗成功率为52%[2]。此外，HIV/MTB感染者的诊治有其特殊性，涉及抗结核和抗-HIV治疗2个方面，药物不良反应、服药依从性、药物间相互作用均会影响治疗效果，HIV感染者结核病的治疗成功率也相对较低[3]。MTB耐药性监测对HIV/MTB感染者极为重要。利福平(RFP)和异烟肼(INH)是结核病治疗中最重要的两种一线药物，结核病患者如果对这两种药物产生耐药将给治疗带来极大的困难。了解RFP及INH耐药株相关耐药基因突变特征，对揭示MTB耐药机制，实现对耐药MTB的快速检测有重要意义。本研究采用基因芯片技术对云南省208例HIV/MTB感染者标本进行MTB耐RFP基因RNA聚合酶β亚单位编码基因(rpoB)，耐INH基因过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因(katG)、烯酰基还原酶编码基因(inhA)的常见突变位点检测，以了解云南省HIV/MTB感染者MTB耐RFP基因rpoB、耐INH基因katG、inhA突变频率和突变特征，以期阐明云南省HIV/MTB感染者MTB对RFP和INH的耐药机制及分子基础，为HIV/MTB感染者MTB耐药的快速诊断和筛选提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2012年9月至2017年12月本院感染科收治的HIV/MTB感染者208例，其中男144例，女64例，年龄17～83岁，平均(39.9±12.7)岁。所有患者HIV感染的诊断均符合原国家卫生部2008年颁布的《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》，所有患者标本抗酸染色或分枝杆菌培养阳性且经基因芯片技术菌种鉴定证实为MTB。208例标本中痰液152例，脓液20例，灌洗液15例，胸腔积液13例，腹水4例，粪便4例。

1.2仪器与试剂 采用北京博奥生物有限公司生产的MTB耐药基因芯片检测试剂及LuxScan10K-B微阵列芯片扫描仪等配套仪器进行检测。

1.3方法 MTB耐药基因检测包括两种一线药物(RFP及INH)的3种耐药相关基因(rpoB、katG及inhA)启动子的野生型及不同变异型。对于RFP耐药相关基因rpoB检测6个位点，包括531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位CAA→AAA、516位GAC→GTC、516位GAC→TAC、516位GAC→GGC、533位CTG→CCG等13种突变型；对于INH耐药相关基因katG及inhA基因启动子各检测1个位点，分别为katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC 2个突变型，inhA基因启动子15位C→T突变型。检测探针和对照探针各重复5个点，每行1～5和6～10分别为同一探针，RFP相关rpoB基因的探针排列示意见表1，INH相关katG基因和inhA基因的探针排列示意见表2。

表1 RFP相关rpoB基因的探针排列

注：QC为表面化学质控探针；EC为杂交阳性外对照探针；BC为空白对照；NC为阴性对照探针；IC为内对照探针；WT为野生型

表2 INH相关katG基因和inhA基因的探针排列

注：QC为表面化学质控探针；EC为杂交阳性外对照探针；BC为空白对照；NC为阴性对照探针；IC为内对照探针；WT为野生型

1.3.1标本制备 取患者标本加入离心管中，95 ℃水浴30 min灭活处理后加等体积N-乙酰-L半胱氨酸-氢氧化钠对标本进行液化处理，取1 mL液化标本加入离心管高速离心后去上清液备用。将处理好的标本放入晶芯ExtractorTM 36核酸快速提取仪中提取核酸，再将提取到的核酸加入到基因扩增仪中进行扩增，并将得到的核酸置于-20 ℃保存。

1.3.2芯片杂交 取杂交缓冲液9 μL、聚合酶链反应(PCR)产物6 μL，混匀，95 ℃热浴5 min，变性，在冰水混合物中骤冷3 min。取13.5 μL杂交溶液加入芯片，置杂交仪，50 ℃杂交2 h后置洗干仪内洗涤甩干。

1.3.3扫描判读 将芯片插入芯片扫描仪内，运行芯片扫描和结果判读。

2 结 果

2.1RFP和INH总体耐药情况 208例标本中共发现34例(16.3%)耐药，其中单耐RFP 6例(2.9%)，单耐INH 10例(4.8%)，二者同时耐药18例(8.7%)。

2.224例MTB对RFP耐药相关基因rpoB的突变特征 见表3。208例标本中共发现24例RFP耐药基因rpoB发生突变，总突变率为11.5%，其中单位点突变23例(95.8%)，突变形式主要为rpoB531TCG→TTG；双位点突变1例(4.2%)，突变形式为rpoB511CTG→CCG加rpoB516GAC→TAC。

表3 24例MTB对RFP耐药相关基因rpoB的突变特征

2.328例MTB对INH耐药相关基因katG和inhA的突变特征 见表4。在208例标本中共发现28例INH耐药基因katG和inhA发生突变，总突变率为13.5%，其中katG突变及缺失26例，突变形式主要为katG315 AGC→ACC；inhA突变2例，突变形式为inhA-15C→T。

表4 28例MTB对INH耐药相关基因katG和inhA的突变特征

3 讨 论

RFP与INH是应用最广泛的一线抗结核药物，二者组合能取得较好的疗效，但由于长期治疗不当，包括治疗方案不当、剂量不足、患者依从性差等原因，RFP与INH耐药率呈上升趋势，这也是TB在全球再次暴发难以控制的主要原因之一。MTB的耐药性是相关基因突变引起的，故对RFP和INH的耐药性进行检测对临床治疗结核有积极意义[4]。

传统的MTB药敏试验阳性率低、培养周期长，给临床上HIV/MTB感染者的诊断和治疗带来了极大的困难。基因芯片是近几年在医疗领域最具影响力的分子生物学检测技术，可通过检测耐药突变基因的存在与否协助判断MTB的耐药情况。国内多中心验证结果表明，基因芯片技术检测RFP、INH耐药性，其敏感度分别为87.56%、80.34%，特异度分别为97.95%、95.82%[5]。基因芯片技术适宜多种类型标本的检测，检测时间较传统方法明显快速，从而做到及早诊断、及时选择敏感药物，及时控制结核病疫情。

多项研究结果表明，HIV/MTB感染者对抗结核药物的耐药性以耐RFP和INH最为突出。王印等[6]报道，成都地区196例HIV合并MTB双重感染者MTB总耐药率为26.02%，其中INH和RFP在4种一线抗结核药中耐药率最高，分别为21.94%和16.33%；汪亚玲等[7]对25例HIV合并MTB阳性病例进行耐药性分析发现其耐药率为16.00%。本研究中MTB总耐药率为16.30%，与上述报道略有差异，这可能与研究方法不一致、不同地域传染流行不太一致有关。

RFP通过与RNA聚合酶β亚单位结合，干扰、抑制mRNA的转录，从而达到杀菌的效果，rpoB基因突变使RNA聚合酶高度保守的氨基酸发生置换，进而阻止RFP的结合而导致耐药。在MTB耐RFP分离株中，90%以上在所分析的rpoB基因不同部位存在多种突变，突变一般发生在rpoB 507～533位27个氨基酸密码子(81 bp)组成的RFP耐药决定区(RRDR)内。其中最常见的突变位点是531位的丝氨酸(Ser)(40%～60%)、526位的组氨酸(His)(30%～36%)、516位的天冬氨酸(Asp)(7%～9%)[8]。rpoB基因突变特征具有明显的地域性差异，不同国家和地区RFP耐药MTB的rpoB基因变异谱和变异率呈现出不同的特点，这可能与rpoB特定位点突变致耐RFP菌种在某一特定地域传染流行有关，也可能与研究标本量少和抽样方法不一致有关。本研究结果显示，云南省HIV/MTB感染人群中RFP耐药MTB的rpoB基因突变以RRDR-531(TCG→TTG，Ser→Leu)为主(66.7%)。国内外研究结果表明，531位密码子突变一般导致高水平耐药，与传统药敏试验有较好的一致性，该突变作为RFP耐药MTB诊断的分子标记靶点有较好的临床应用价值。

MTB对INH的耐药机制与katG、inhA和ahpC基因的启动子缺失或突变有关，其中katG完全缺失或点突变是最主要的耐药机制[9]。katG基因变异会导致其编码产物过氧化氢-过氧化物酶的活性丧失或降低，使INH不能活化，从而不能攻击分枝菌酸，导致MTB对INH耐药[10]。inhA启动子变异会增强烯酰基乙酰载体蛋白还原酶的表达，超过了药物抑制作用，从而使菌株耐受INH[11]。katG基因中常见的突变率位点是315位(AGC→ACC，Ser→Thr)，发生率约为60.00%[8]。本研究中云南省HIV/MTB感染人群中INH耐药MTB的katG基因突变以315位(AGC→ACC，Ser→Thr)为主(78.6%)，较60.00%略高，这可能与检测人群不一致、不同地区菌株耐药相关基因变异存在多态性，突变类型、位点、频率各不相同有关。本研究中还检出1例katG基因完全缺失，在MTB耐INH分离株中，有2%～10%的分离株发生katG基因完全缺失，而且主要出现在高度耐INH菌株中，故katG基因缺失对MTB耐INH有较好的指导意义。在MTB耐INH分离株中，10%～35%的分离株在inhA启动子区域发生突变，最常见的突变位点是15位[8]。本研究中仅有2株耐药菌检出15位突变，原因可能是该基因耐药株不是云南省HIV/MTB人群中流行的优势耐药菌株，或者此基因变异率不高，但尚需扩大标本量进行验证。

综上所述，本研究阐明了云南省HIV/MTB感染者中MTB耐RFP rpoB基因的主要突变位点为531(TCG→TTG)，耐INH katG、inhA基因的主要突变位点为katG基因315(AGC→ACC)，其作为耐多药结核诊断的分子标记靶点有较好的临床应用价值。