法舒地尔对肝纤维化大鼠肝脏缺血再灌注损伤的有效剂量

向 华 黄攀科 苏 铭 杨 军 王 谦

(遵义医学院附属贵航三○○医院普通外科，贵州 贵阳 550009)

肝纤维化是病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病等进展到肝硬化的共同病理过程〔1〕。晚期肝纤维化导致的肝硬化是一种由肝纤维组织增生，细胞弥漫性变性、坏死，肝细胞结节状再生反复交错导致肝脏变硬、变形的慢性肝脏疾病〔2〕。肝硬化常伴随多种并发症，如门脉高压和肝功能减退等。肝硬化患者常需要肝切除或肝移植手术。在肝移植或肝叶切除等过程中，肝缺血再灌注损伤(HIRI)不可避免，是影响手术效果的重要因素之一。枯否细胞活化、多种细胞因子释放和氧化应激均与HIRI有密切关系，而这些因素可激活肝星状细胞(HSC)，促进肝纤维化进程〔3〕。Rho及其下游的Rho激酶(ROCK)在细胞增殖、黏附和迁移等调控中发挥重要作用，RhoA/ROCK 信号转导通路被证实在肝纤维化进程中扮演重要角色〔4〕。法舒地尔作为ROCK抑制剂，可通过抑制ROCK活性，阻断Rho/ROCK信号通路，从而延缓肝纤维化，发挥肝脏保护作用〔5〕。本研究拟探讨法舒地尔对肝纤维化大鼠HIRI的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 清洁级雄性SD大鼠90只，体重230～260 g，平均(250±15)g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。大鼠适应性饲养1 w。

1.2主要试剂 盐酸法舒地尔注射液(四川升和药业股份有限公司)；水合氯醛合剂(美国Sigma公司)；谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒(上海铭博生物科技有限公司)；其他试剂均为分析纯国产试剂。

1.3主要仪器 超净工作台(AIRTECH，苏州净化设备有限公司)，紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)，iChem-530全自动生化分析仪(深圳市库贝尔生物科技股份有限公司)。

1.4肝纤维化动物模型构建 SD大鼠90只随机分为实验组(n=85)和对照组(n=5)。手术前12 h禁食不禁水，麻醉(10%水合氯醛)，仰位固定于固定板上，备皮、碘胺酮消毒铺巾，沿腹部正中线作2 cm切口，发现胃幽门部，于十二指肠降部肠系膜中发现白色有韧性的胆管，游离胆总管，采用2根5-0号缝线结扎胆总管。术后缝合皮肤，肌肉注射青霉素80万U 2～3 d。对照组不做胆总管结扎及离断，其余操作同实验组。术后正常饲养，适当控制饮食，密切观察大鼠生活状态变化，于术后第7和14天分别皮下注射 50 μg VitK1，术后第18天实验组随机选取5只大鼠和对照组所有大鼠，处死，取肝左外叶制作石蜡切片，行苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织病理学形态，肝纤维化大鼠模型建立成功标准为肝组织病理切片显示纤维化病变。

1.5干预方法 采用随机数字表法将实验组剩余80只大鼠分为假手术组、HIRI组、法舒地尔1组和法舒地尔2组，每组20只。开腹显露肝蒂，假手术组和HIRI组经腹腔注射生理盐水5 ml/kg;法舒地尔1组和法舒地尔2组分别注射20 μg/kg和80 μg/kg法舒地尔；HIRI组、法舒地尔1组和法舒地尔2组30 min后阻断肝门20 min，假手术组不阻断肝门，解除阻断并关腹，术毕4 h取各组6只大鼠血液和肝组织标本进行相关指标的检测。

1.6AST、ALT、MDA、SOD和TNF-α检测 采集各组大鼠眼眶血，以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α，以水溶性四唑盐法检测肝组织 SOD活性，以硫代巴比妥酸法检测肝组织 MDA 水平，以ELISA法检测血清AST、ALT水平。

1.7HE染色 取左肝外叶组织，制备组织病理切片，切片脱蜡，水洗，经苏木素染色5 min，水洗，70%酒精和1%盐酸分化，返蓝，水洗，伊红染色，酒精脱水，二甲苯透明，封片后于显微镜下观察肝组织病理改变。

1.896 h死亡率 记录各组余14只大鼠96 h生存情况，统计生存率。

1.9统计分析 采用SPSS18.0软件进行χ2检验、t检验，生存率分析采用Kaplan-Meier法。

2 结 果

2.14组肝功能比较 与假手术组相比，HIRI组、法舒地尔1组和法舒地尔2组血清AST和ALT水平显著上升(P<0.05)；法舒地尔1组和法舒地尔2组血清AST和ALT水平显著低于HIRI组(P<0.05)，且法舒地尔2组显著低于法舒地尔1组(P<0.05)。见表1。

表1 4组血清AST、ALT水平及肝组织MDA、SOD含量比较

与假手术组比较：1)P<0.05；与HIRI组比较：2)P<0.05；与法舒地尔1组比较：3)P<0.05

2.24组肝组织MDA和SOD含量比较 与假手术组相比，HIRI组、法舒地尔1组和法舒地尔2组肝组织MDA含量显著上升，SOD含量显著下降(P<0.05)；法舒地尔1组和法舒地尔2组肝组织MDA含量均显著低于HIRI组(P<0.05)，SOD含量显著高于HIRI组(P<0.05)，且法舒地尔2组和法舒地尔1组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.34组血清TNF-α水平比较 与假手术组〔(33.19±5.16)pg/ml〕相比，HIRI组、法舒地尔1组和法舒地尔2组血清TNF-α水平〔(63.22±11.75)、(51.36±12.15)、(45.38±8.52)pg/ml〕显著上升(P<0.05)；法舒地尔1组和法舒地尔2组显著低于HIRI组(P<0.05)，且法舒地尔2组显著低于法舒地尔1组(P<0.05)。

2.4HE染色 假手术组肝组织切片可见纤维结缔组织增生、小叶结构紊乱，假小叶形成；HIRI组肝组织切片可见中心粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润，部分出现肝细胞坏死；法舒地尔1组和法舒地尔2组同样可见中心粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润，但肝细胞坏死明显减轻。见图1。

2.5生存率 假手术组、HIRI组、法舒地尔1组和法舒地尔2组96 h生存率分别为78.57%、28.57%、50.00%和64.29%。法舒地尔1组和法舒地尔2组与HIRI组总体生存时间差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图1 组织病理观察(HE，×100)

图2 各组96 h生存率比较

3 讨 论

在肝部分切除手术中，为了降低手术出血量，外科医生需要使用Pringle法阻断第一肝门，然而由于第一肝门的阻断基本阻断入肝血流，可导致肝脏缺血损伤，而术后解除阻断后即可发生HIRI。HIRI不仅可能影响肝脏正常功能的恢复，而且可导致心、肺、肾等器官受累〔6～8〕。研究表明，肝门阻断技术虽然可显著降低肝部分切除手术中出血量，但并不能降低患者术后并发症发生率和死亡率。主要是由于肝脏对HIRI高度敏感，HIRI可导致肝衰竭甚至死亡〔9〕。因此，亟需解决肝部分切除手术中Pringle法导致的HIRI对肝脏的损伤。HIRI的病理生理过程十分复杂，目前其确切机制尚不十分清楚，主要与炎症反应、氧化应激、细胞信号转导、细胞凋亡和自噬等有关〔10，11〕。随着研究的深入，目前临床上对HIRI的干预方法越来越多，如缺血预处理和药物处理等，但由于前者存在增加相应并发症、手术时间和促进血栓形成的风险，其临床应用受到限制，而药物处理受到广泛关注〔12〕。ROCK是一种研究较为清楚的重要激酶之一，其主要功能是参与细胞骨架的重构、细胞迁移、黏附和分裂及调节中性粒细胞产生活性氧等，在炎症导致的细胞组织损伤中发挥重要作用〔13〕。研究证实，RhoA/ROCK信号转导通路与缺血性脑血管疾病密切相关〔14〕。RhoA/ROCK信号转导通路可被过氧化物、过氧化低密度脂蛋白、血管内皮生长因子等激活。

本研究结果表明，法舒地尔有助于减轻缺血再灌注引起的肝损伤，并呈剂量依赖性。SOD是机体内清除氧自由基的主要酶类之一，HIRI可抑制其活性，从而导致大量超氧自由基积累，直接破坏肝细胞。MDA是一种不饱和脂肪酸氧化分解后的产物，其含量高低提示组织细胞遭受过氧化损伤程度。本研究结果证明，法舒地尔可增强抗氧化应激能力，从而减轻肝组织过氧化损伤。洪晓鹏等〔15〕报道，法舒地尔对大鼠缺血再灌注损伤肝脏具有保护作用，可能与抑制中性粒细胞浸润和提高机体抗氧化应激能力有关，与本研究结果一致。作为ROCK抑制剂，法舒地尔是一种新型异喹啉磺胺衍生物，抑制RhoA/ROCK信号转导通路介导的HSC活化，从而起到肝脏保护作用〔16〕。细胞因子是导致RhoA/ROCK激活的重要因素之一，TNF-α被证实参与了肝衰竭过程，阻断TNF-α有助于阻断肝脏坏死的发生〔17〕。另外，本文结果表明，法舒地尔有助于提高肝衰竭动物生存率。陈少华等〔18〕报道，法舒地尔对梗阻性黄疸大鼠肝切除后肝衰竭模型具有保护作用，提高生存率。综上，法舒地尔对肝纤维化大鼠HIRI后肝脏具有保护作用，且呈剂量依赖性，可能通过提高机体的抗氧化能力，降低炎症细胞因子水平和脂质过氧化水平而发挥作用。