β-淀粉样蛋白在老龄大鼠术后认知功能障碍中的作用及石杉碱甲的干预作用

邓福谋 罗晓东 郎海丽 姚 鹏 方四通 陈 勇 余树春 徐国海

(南昌大学第二附属医院麻醉科 江西省麻醉学重点实验室，江西 南昌 330006)

术后认知功能障碍(POCD)是指患者在手术后出现认知功能(包括学习、记忆、情绪、情感及判断力等)整体下降或衰退〔1,2〕，目前其发病机制尚不完全清楚，也尚未发现有效改善POCD的药物及方法。β-淀粉样蛋白(Aβ)是一种功能未完全明确的跨膜蛋白，已被证实与阿尔茨海默病(AD)早期老年斑形成关系密切,与神经功能损伤有密切关系，也被称为是AD的始动因子〔3〕。石杉碱甲(HupA)是一种天然新型石松类生物碱有效单体，同时也是一种高效可逆性的胆碱酯酶抑制剂，具有改善学习及记忆功能的作用〔4,5〕，但其是否可减轻老龄大鼠术后认知功能及Aβ是否参与其减轻POCD的过程尚不清楚，本研究拟评价HupA对老龄大鼠POCD的影响及Aβ在其中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物分组及处理 健康老年雄性SD大鼠(南昌大学实验动物科学部提供)72只，20～22月龄，体重550～700 g，采用随机数字表法分为对照组(C组)、POCD组(P组)和Hup A组(H组)，每组24只。H组和C组在手术前给予Hup A(河南竹林众生制药公司，批号：20150101)0.15 mg·kg-1·d-1灌胃，连续3 w，P组按体重给予等容量生理盐水；3 w后P组和H组行脾切除术，C组不行手术。

1.2模型制备 参照文献〔6〕介绍的方法采用脾切除术建立老龄大鼠术后认知功能障碍模型。术前禁食12 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠40 mg/kg，待麻醉成功后仰卧位固定，腹部皮肤备皮，消毒铺巾，正中切口开腹，游离脾脏，结扎脾动静脉，将脾脏切除后止血关腹，用无菌敷料贴覆盖，胶布固定，待大鼠苏醒后单独饲养。术中严格无菌操作，术毕腹腔内给予5%头孢哌酮注射液50 mg/kg预防伤口感染。

1.3大鼠认知功能的测定 采用Morris水迷宫进行测试。所有大鼠于术前5 d进行适应性学习，每天在水迷宫中自由游泳5 min以适应环境，分别于手术后第1、3天和7天(T1～T3)时进行观察，分别从四个象限的池壁中点将大鼠面向池壁放入池中，记录其在120 s内寻找到平台的时间，即为逃避潜伏期。术后第8天，将原平台撤除，记录其在120 s内穿越原先平台所在位置的次数，即为穿越平台次数。

1.4血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-10浓度的测定 分别于T1～T3时每组随机取8只大鼠，采集血样，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清TNF-α、IL-6和IL-10浓度。实验步骤按照试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)说明书操作。

1.5海马Aβ表达的测定 分别于T1～T3时每组随机取8只大鼠的海马组织，匀浆，加入蛋白裂解液，提取总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，1∶5加入6×上样缓冲液，100℃水浴锅煮沸10 min，12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，敷一抗4℃孵育过夜，次日TBST漂洗10 min×3次，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(稀释度1∶5 000)室温孵育1 h，二氨基联苯胺(DAB)显色，采用GelPro4.5 图像分析软件，以光密度值与内参β-actin光密度值的比值反映目的蛋白表达水平。

1.6统计学处理 应用SPSS20.0软件，计量资料组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。

2 结 果

2.1三组术后各时点逃避潜伏期和穿越平台次数比较 与C组比较，P组T1～T3时点逃避潜伏期延长，H组T1时逃避潜伏期延长，P组和H组穿越平台次数均减少(P<0.05)；与P组比较，H组T1～T3时点逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加(P<0.05)，见表1。

表1 三组术后各时点逃避潜伏期和穿越平台次数比较

与C组比较：1)P<0.05；与P组比较：2)P<0.05；下表同

2.2三组血清TNF-α、IL-6、IL-10及海马Aβ表达比较 与C组比较，P组和H组血清TNF-α、IL-6及IL-10浓度均升高(P<0.05)；与P组比较，H组血清TNF-α及IL-6浓度降低，IL-10浓度升高(P<0.05)，见表2。与C组比较，P组和H组海马Aβ表达上调(P<0.05)；与P组比较，H组海马Aβ表达下调(P<0.05)，见表3、图1。

表2 三组术后各时点血清TNF-α、IL-6及IL-10浓度比较

表3 三组术后各时点海马Aβ表达比较

图1 三组海马Aβ表达比较

3 讨 论

虽然POCD的发病原因尚未完全清楚，但年龄是目前唯一已确定的因素，伴随着年龄的增加，POCD的发生率也显著升高，尤其是年龄超过70岁的老年患者〔7〕。同样在动物实验中也已经证实，老龄大鼠术后空间记忆力较年轻大鼠明显降低〔8〕。因此，本研究选取老龄大鼠作为研究对象。

Morris水迷宫实验是评价啮齿类动物空间学习记忆功能最经典的方法〔9〕。本研究显示，手术操作可导致老龄大鼠术后出现认知功能障碍，表明老龄大鼠POCD模型制备成功。本研究结果显是示术前给予HupA可减轻老龄大鼠术后认知功能障碍。

TNF-α和IL-6是机体炎性反应中重要的促炎性细胞因子，IL-10则是公认的炎症及免疫抑制因子。本研究结果表明，手术应激可引起老龄大鼠围术期炎性细胞因子释放增多并诱发炎性反应，而术前给予HupA可降低围术期炎性细胞因子的释放，从而在一定程度上减轻炎性反应，其机制可能是HupA通过增强胆碱能抗炎通路减轻炎性反应。

Aβ是AD患者老年斑中的主要组成成分，同时也是神经损伤和炎症反应潜在的标记物，可诱发神经递质失调及突触功能障碍，导致乙酰胆碱合成减少；同时也可促进炎性细胞因子表达，诱导神经元凋亡及神经胶质细胞增生，从而导致学习和记忆功能障碍〔11〕。本研究结果提示HupA可减轻老龄大鼠术后认知功能障碍，其机制可能与其下调海马组织Aβ表达有关。HupA是一种高选择性的可逆性胆碱酯酶抑制剂，易通过血脑屏障，发挥拟胆碱作用，抑制乙酰胆碱水解，从而增加神经突触间隙的乙酰胆碱含量〔12〕；HupA还能减少谷氨酸诱发的神经元凋亡，保护神经元对抗Aβ产生的氧化应激反应及神经细胞凋亡作用〔13〕；还具有抑制一氧化氮(NO)的神经毒性及对记忆损害的修复作用〔4〕；此外，HupA还可对胆碱能受体发挥直接作用，刺激毒蕈碱乙酰胆碱受体，并激活蛋白激酶C(PKC)，增加α-分泌酶活性，从而减少Aβ的产生〔14〕。

综上所述，HupA可减轻老龄大鼠术后认知功能障碍，机制可能与其降低炎性反应及下调海马组织Aβ表达有关。