QuEChERS/高效液相色谱串联质谱法测定渔业饲料中敌百虫、敌敌畏、蝇毒磷的含量

肖 维， 万译文*， 伍远安， 杨 霄， 索纹纹

（1.湖南省水产科学研究所，湖南长沙410153；2.水产健康生产湖南省协同创新中心，湖南常德 415000）

敌百虫、敌敌畏与蝇毒磷均属于有机磷农药，作为一种杀虫剂，有机磷农药具有广谱、高效、低毒、使用方便等特点，广泛应用于农业、畜牧业、水产、林业等方面的防虫或杀虫工作（侯文慧，2016；杨立新等，2010；Ragnarsdottir，2000）。 在渔业饲料中，敌百虫、敌敌畏及蝇毒磷被作为防腐防虫剂被使用（韩梅，2012），而农药残留会随着饲料进入水产品，影响水产品的质量安全，危害人体健康。因此有必要对渔业饲料中敌敌畏、敌百虫及蝇毒磷的残留检测建立一个简便、高准确度和高灵敏度的检测方法。

目前，敌百虫、敌敌畏与蝇毒磷的残留检测主要是采用气相色谱法（王耀等，2010）和气相色谱质谱联用法（Hu等，2012）。而这两种方法前处理复杂，有机溶剂消耗大，在分析的过程中，敌百虫因其结构不稳定，在高温中分解成敌敌畏导致定量结果不准确。而采用液相色谱质谱联用法时，对极性有机磷选择性高，同时前处理过程比气相色谱法或气相色谱-质谱联用法简单，净化方式可选择多，因此，建立液相色谱-质谱联用法同时检测敌敌畏、敌百虫及蝇毒磷就较为必要。目前，采用液质法对水产品中敌百虫与敌敌畏残留进行检测虽有报道（黄冬梅等，2012），但在前处理过程中均采用的C18小柱进行固相萃取净化。

分散型固相萃取（QuEChERS）方法是一种快速、简单、经济、高效、抗干扰、安全的样品前处理方法，其原理是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质达到除杂净化的目的 （刘亚伟，2009；Steven，2005、2004）。 考虑到渔业饲料中成分比较复杂，基质中含有大量的脂肪、蛋白质、碳水化合物以及色素等杂质，本文建立一种利用QuEChERS法进行样品净化，高效液相色谱-质谱联用来检测渔业饲料中的敌百虫、敌敌畏及蝇毒磷的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 敌百虫、敌敌畏、蝇毒磷标准品：纯度均大于99.9%，美国Sigma公司；乙腈、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯（色谱纯），美国天地公司；C18填料，天津科密欧化学有限公司；中性氧化铝（分析纯），天津科密欧化学有限公司；硫酸镁（分析纯），天津科密欧化学有限公司；超纯水，美国Milli-Q纯水系统制水。

1.2 仪器与设备 TSQ高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪（美国Thermo公司）；高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；MX-S旋涡混匀仪（美国Scilogex公司）；超精密电子天平 （日本日立公司）；超声波清洗器（昆山超声波仪器厂）。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制 分别称取一定量的敌百虫、敌敌畏、蝇毒磷标准品，用甲醇溶解定容配置成1.0 mg/mL的混合标准储备液。使用时按照需要用流动相将上述标准储备液稀释成不同浓度的标准工作液。

1.3.2 样品前处理方法 准确称取饲料样品2.0 g（精确到0.01 g）于离心管中，往离心管中加入含0.1%甲酸的10 mL乙腈，混匀器上混匀2 min后超声，放入离心机以6000 r/min离心10 min静置。移取1 mL上层澄清液于10 mL离心管中，加入0.2 g中性氧化铝、0.5 g无水硫酸镁及0.5 g C18吸附剂后旋涡混匀，10000 r/min离心5 min，取上清液过0.22μm滤膜后供LC-MS/MS测定。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱为资生堂CAPCELL PAK C18（100 mm×2.5 mm，2.5 μm）；柱温为 30 ℃，进样量为20μL，流动相A为甲醇；B为2 mmoL/L的乙酸铵溶液（含0.1%的甲酸）；采用梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件 采用大气压电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压为3500 V；鞘气流速为0.17 L/h；辅助气流量为0.03 L/h；采用ESI+MRM多反应监测模式进行离子监测，敌百虫、敌敌畏及蝇毒磷的监测离子对、碰撞能量、线性方程及相关系数见表2。

表2 3种化合物的SRM采集参数

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的选择及优化

2.1.1 提取溶剂的选择 有机磷农药常用的提取剂有乙腈、正己烷、乙酸乙酯、石油醚等有机溶剂，本文采用这四种不同有机溶剂来对样品进行提取，得到了敌百虫、敌敌畏及蝇毒磷的回收率。由结果可知，石油醚对上述三种有机磷农药提取的效率低，回收率为40%～60%；采用正己烷提取时，三种待测物均得到了有效的提取，回收率也满足要求，但是样品基质中含有大量脂肪也溶解于正己烷中，不利于后期的净化，造成对质谱离子源的污染；采用乙腈和乙酸乙酯提取也能取得较好的效果，乙腈能有效提取大多数农残及药残的目标物，提取效果好且能有效的沉淀样品中的蛋白质，乙酸乙酯的提取液中含有少量杂质，容易造成乳化现象，不利于净化过程，造成色谱柱堵塞。因此本文采用甲酸化乙腈作为目标物的提取剂，敌百虫在碱性环境中不稳定，容易分解成敌敌畏而造成敌敌畏的回收率偏高而敌百虫的回收率偏低，因此在乙腈中加入一定的酸有助于防止敌百虫的分解。

2.1.2 净化方式的选择 目前前处理过程中常用的净化方式有使用正己烷去脂、固相萃取两种方式。本文采用QuEChERS进行净化，由于市场上待售的饲料含有蛋白质和脂肪，为了得到良好的净化效果，选择无水硫酸镁、中性氧化铝和C18填料作为吸附剂，中性氧化铝和C18填料具有良好的除脂能力，而无水硫酸镁能有效去除色素和水分。为考察这3种吸附剂对目标物的吸附情况，在同一浓度水平的混合标准溶液中分别加入1000 mg的3种吸附剂充分混匀1 min，过0.22μm滤膜后测定，发现C18填料的吸附极强，敌百虫与敌敌畏的回收率偏低，回收率小于50%；而中性氧化铝的吸附能力比较弱，可作为净化剂进一步优化。根据饲料提取液中残留脂肪和色素的含量特点，考察了100～500 mg中性氧化铝、500～1000 mg无水硫酸镁及500～1000 mg C18填料按不同比例组合的净化效果，发现当采用0.2 g中性氧化铝、0.5 g C18填料及0.5 g无水硫酸镁时，能够充分吸附样品中的色素和杂质，使溶液得到良好的净化。采用QuEChERS法净化时简单快速、节约试剂、实验效率高，回收率也满足要求。

2.2 色谱条件的选择及优化 渔业饲料中蛋白质含量高，色素和杂质多，通过前处理净化降低色谱的本底值后，采用合适的梯度洗脱程序，能使目标物得到有效的分离和最佳的质谱响应信号。同时实验比较了乙腈-水 （0.1%甲酸）、甲醇-水（0.1%甲酸）、乙腈-乙酸铵水溶液（0.1%甲酸）、甲醇-乙酸铵水溶液（0.1%甲酸）四种不同的流动相对目标物的分离效果。实验发现，当采用甲醇-乙酸铵水溶液（0.1%甲酸）作为流动相时，使目标物色谱峰峰形尖锐、对称性好，色谱峰的响应强度高。敌百虫、敌敌畏及蝇毒磷的标准溶液SRM色谱图见图1。

图1 敌百虫、敌敌畏及蝇毒磷的SRM图

2.3 质谱条件的选择及优化 根据有机磷农药的结构特征，选择ESI正离子电离模式对三种有机磷农药混合标液进行一级质谱全扫描分析，得到每个目标物的母离子。再选择丰度最大的二级碎片离子作为定量离子，丰度次强的碎片离子为定性离子。敌百虫与敌敌畏标样中子离子109的丰度值最大，蝇毒磷标样中子离子307的丰度值最大，因此选用109和307作为定量离子。在使用液质法进行检测时，本方法选择的子离子均符合欧盟657/2002/EC8规定的识别点要求。

2.4 线性范围和检出限 本实验的标准曲线采用基质加标法进行，称取相同基质的空白样品，分别加入不同体积的混合标准工作液，制备成含有敌百虫、敌敌畏、蝇毒磷的质量浓度为2.0、5.0、20、50、100、200 μg/kg样品，按样品前处理方法操作，采用外标法定量，以待测物的质量浓度X（μg/L）为横坐标，待测物的峰面积比值Y为纵坐标制作标准曲线，由实验得出的线性回归方程、相关系数、检出限（LOD）及定量限（LOQ）见表3。以3倍信噪比为检出限 （LOD），10倍信噪比为定量限（LOQ），结合样品的前处理过程，经过样品添加实验计算后确定方法的检出限和定量限。

表3 3种目标物的线性方程、相关系数、检出限和定量限

结果表明，敌百虫、敌敌畏及蝇毒磷在相应浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.9992～0.9997，按照本文建立的方法进行检测，这三种有机磷农药的方法LOD均为2.0μg/kg，方法的定量限均为 4.0μg/kg。

2.5 回收率和精密度 本方法采用外标法定量，在空白样品中添加不同浓度的目标化合物，按1.3.2中所述条件分别进行添加回收率和精密度实验。在空白样品中添加4.0、10、50μg/kg三个水平的添加实验，每个添加水平检测3次，每次实验平行测定6次，所得结果回收率为82.3%～105.2%，相对标准偏差为1.62%～8.68%，符合国内外有关标准和法规的要求，结果见表4。

3 结论

本文建立的渔业饲料中敌百虫、敌敌畏及蝇毒磷的残留检测方法，准确度和精密度较好，满足对目标物的定性和定量的要求，该方法并可为敌百虫、敌敌畏及蝇毒磷在渔业饲料中的消除规律及毒理评价提供灵敏、准确的分析手段，对食品的安全工作提供了有力的保障。

表4 3种目标物在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差（RSDs，n=6）