堆肥土壤中黄曲霉毒素降解菌株的筛选及活性分析

王佳伟， 宋根娣*， 杨瑞先， 韩 露， 赵振华

（1.洛阳理工学院环境工程与化学学院，河南洛阳 471023；2.河南省畜牧总站，河南郑州 450008）

黄曲霉毒素（AFT）是由黄曲霉或寄生曲霉等真菌在生长后期产生的次生代谢物，能够在收割前后、运输、贮存等多个环节污染如花生、玉米等农产品，造成经济损失，严重制约农业、畜牧业等领域的发展（Rocha等，2014）。目前已经鉴定出的黄曲霉毒素及其衍生物约有20种，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）因其具有高致突变、肝毒性、致畸性及免疫抑制等作用，成为粮食作物和动物饲料最主要的污染物之一（Anthony等，2012；Dors等，2011）。

黄曲霉毒素耐高温，稳定性强，主要的防治策略集中在物理吸附和化学消解等方面，如热处理、蒙脱石吸附、膨化、抗氧化剂处理等（Mishra等，2003；Bailey等，1994）。 这些方法均造成不同程度的营养物质流失，甚至引入新的有害物质（Zhao等，2011）。生物防治主要通过细菌或真菌等微生物及其代谢产物降解霉菌毒素，与理化方法相比，具有处理条件温和，营养物质损失小、专一性强等特点，在黄曲霉毒素的去除方面具有广泛的应用前景 （Samuel等，2014；Alberts等，2006）。目前，已经报道具有降解黄曲霉毒素的细菌主要有红色棒状杆菌、黄杆菌、分支杆菌、短波单胞菌属、红平红球菌、橙色黏球菌、枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌等 （Adebo等，2016；Sangare等，2014）。同时，许多真菌，如假密环菌、糙皮侧耳等也被发现能够降解黄曲霉毒素 （Yehia等，2014；Alberts等，2009）。 但是真菌的培养时间较长，代谢产物复杂，在一定条件下可能产生毒素等特点，制约了其在霉菌毒素降解领域的应用（Eshelli等，2015）。相比之下，细菌更具有大规模生产的潜力，特别是如芽孢杆菌等毒素降解益生菌的开发，在黄曲霉毒素降解方面具有较强的适用性（Adebo 等，2016）。

因此，本研究以动物粪便以及粪便堆肥土壤为材料，分离筛选能够有效降解AFB1的细菌，并对其毒素降解活性进行分析，初步确定了活性物质的性质，为进一步研究其降解机制及在生产中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集和培养基 样品主要为猪牛粪便以及粪便堆肥覆盖土壤（距离表土2～5 cm处）。

菌体扩增用LB培养基：酵母膏5 g，胰蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.2 ～7.4，固体培养基另加18 g琼脂粉。

初筛培养基：KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KNO30.4 g，（NH4）2SO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.005 g，FeCl3·6H2O 0.005 g，pH 7.0， 蒸馏水 1000 mL，琼脂18 g，121°C高压蒸汽灭菌20 min后，加入过滤除菌的香豆素溶液至终浓度为0.1%。

发酵培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，葡萄糖 1 g，加水至 1000 mL，pH 7.0 ～ 7.2，121 °C高压灭菌20 min。

1.2 AFB1降解菌株的分离与筛选 初筛：分别取5 g样品加入95 mL无菌生理盐水稀释混匀，37°C孵育2 h，按照5%接种量接种于LB培养基，170 r/min、37°C振荡培养20 h。取5%菌液接种于初筛液体培养基中传代培养5次，进行初筛菌的富集和驯化。在LB平板上进行划线、培养、挑取单菌落，保存备用。

复筛：将初筛菌株分别接种于发酵培养基，160 r/min、37°C发酵培养3 d。取950μL菌体发酵液与50μL 10μg/mL AFB1标准品置于1.5 mL灭菌离心管中，AFB1标品终浓度为0.5μg/mL，设置相同比例的无菌发酵培养基加AFB1标品为空白对照，37°C避光孵育3 d。

1.3 AFB1的提取与检测 将孵育3 d后的样品12000 r/min离心5 min，取上清，10%甲醇水溶液稀释，用ELISA检测试剂盒（美国Beacon）进行AFB1含量的检测，具体步骤参见试剂盒说明书。

AFB1降解率/%=（对照组AFB1含量-试验组AFB1含量）/对照组 AFB1含量×100。

1.4 菌株的鉴定 通过对比筛选菌株的AFB1降解率，挑选降解率最高的菌株，命名为SG16。分别通过细胞形态、生理生化检测及16SrRNA序列分析鉴定其种属。

细胞形态鉴定：将SG16菌株划线培养在LB平板，37°C培养2 d，观察菌落形态。挑取单菌落进行革兰氏染色。

生理生化鉴定：参考《伯杰氏细菌鉴定手册》第8版，进行SG16菌株的V-P、水解淀粉、明胶液化和甲基红等试验。

16SrRNA序列分析：细菌DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取SG16基因组 DNA， 以 16S rRNA 通用引物 27F：5’-AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’ -GGT TACCTTGTTACGACTT-3’，进行PCR扩增。扩增程序：94 °C 5 min；94 °C 40 s，55 °C 40 s，72 °C 1 min；72°C 10 min，35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶（含EB）110 V电泳25 min，凝胶成像系统采集图像。扩增片段送上海生工生物工程有限公司（上海）测序。采用Clustal X 2.0软件进行序列对比，并通过MEGA 5.0软件构建Neighbour-Joining（NJ）系统发育树，Bootstrap重复1000次。

1.5 SG16对AFB1的降解活性分析 发酵液各组分的降解活性：按照5%接种量将SG16接种于发酵培养基，取5 mL菌体发酵液12000 r/min、4°C离心10 min，制备发酵上清液。菌体细胞用无菌蒸馏水洗涤3次，重悬于5 mL无菌蒸馏水，制备细胞悬液。洗涤后的菌体细胞加入5 mL无菌蒸馏水，超声波破碎（工作条件：超声时间4 s，间隙时间 5 s，工作次数：一轮 50 次，共 2 轮），12000 r/min、4°C离心15 min，取上清为胞内液组分。按照复筛的方法，将SG16菌体培养液（全发酵液）、发酵上清液、菌悬液、胞内液分别与AFB1标品共孵育，以无菌蒸馏水稀释AFB1标品作为空白对照，分别 在 3、6、12、24、48、72 h 取 样 检 测 各 组 分 对AFB1的降解率，每个样品3次重复。

浓缩发酵液的制备与降解率检测：取100 mL SG16菌体发酵液，12000 r/min、4°C 离心 15 min，收集上清液，聚乙二醇20000透析浓缩100倍，制备浓缩发酵液，与AFB1标品共孵育，检测降解率。

发酵时间对发酵液降解活性的影响：将SG16菌株采用5%接种量，37°C发酵培养，从培养24 h开始，每间隔12 h取样，制备浓缩发酵液，进行AFB1降解率检测，确定SG16菌株的最佳发酵时间。

温度对发酵液降解活性的影响：毒素降解反应的环境温度选择 20、30、37、40 °C 及 50 °C 五个梯度。将50μL AFB1加入无菌离心管，温度达到稳定后，再加入浓缩发酵液，避光孵育48 h，检测毒素降解率。

pH对发酵液降解活性的影响：分别采用柠檬酸盐-磷酸盐溶液和Tris-HCl溶液制备pH 4～9的缓冲液。取不同pH的缓冲液与浓缩发酵液混匀，使混合发酵液的初始pH为4.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，分别取相同浓度的混合发酵液与AFB1标品共孵育48 h后，检测降解率。以各自pH的等浓度无菌发酵液加AFB1作为空白对照。

金属离子、蛋白酶K对发酵液降解活性的影响：制备浓缩发酵液和AFB1的混合物，分别加入ZnSO4、MgSO4、MnSO4、FeSO4、CuSO4以 及 蛋 白 酶K，金属离子的终浓度均为10 mol/mL，蛋白酶K的终浓度为1 mg/mL。避光孵育48 h后，以未处理浓缩发酵液为空白对照，检测降解率。

1.6 浓缩发酵液对玉米中AFB1的降解分析 将玉米样品粉碎过筛，取直径1.2～1.8 mm的玉米颗粒50 g，37°C、湿度80%放置12 d制备霉变玉米。取10 mL浓缩发酵液与发霉颗粒混匀，37°C培养72 h，每隔12 h混匀一次。依照GB 5009.22-2016（食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定）分别对发霉玉米和发酵液处理72 h后的AFB1含量进行检测。

1.7 数据分析 试验数据均采用SPSS 17.0统计软件进行分析，结果用“平均数±标准差”表示，不同组间的差异性分析采用one-way ANOVA方法，其中P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 降解菌株的筛选和鉴定 以香豆素为唯一碳源进行富集和驯化，共获得6株可利用香豆素的菌株，其中3株来源于动物粪便，3株来源于粪便堆肥的土壤。进一步复筛发现，这6株菌对AFB1均表现不同程度的降解活性，其中活性最低的为土壤源的SG18，降解率为13.83%，降解活性最高的为土壤源的SG16，降解率为85.50%。因此，进一步的研究选择SG16作为目标菌株。

菌株SG16在LB培养基上菌落大而凸起，表面粗糙呈白色，革兰氏染色呈阳性，杆状，两端钝圆（图1）。生理生化检测结果显示，SG16菌株能分解葡萄糖、淀粉、明胶等大分子物质，符合芽孢杆菌能够利用蛋白质、多糖和淀粉的特性，结合菌落观察，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（8版）初步判断SG16菌株属于芽孢杆菌属。

图1 SG16菌株的形态学观察

利用SG16基因组DNA为模板扩增16S rRNA片段，条带回收，测序后片段大小1472 bp，利用同源序列构建系统发育树（图2）。结果显示，SG16菌株与解淀粉芽孢杆菌BFE5300（登录号：GU250445.1）同源性最高为99%。因此，综合形态特征、生理生化结果以及系统发育树，可以初步确定SG16为解淀粉芽孢杆菌。

图2 根据16S rRNA序列构建系统发育树

2.2 SG16发酵组分对AFB1的降解作用 对比SG16菌体培养液、菌悬液、胞内液以及发酵上清对AFB1的降解率，如图3所示，菌体培养液是全发酵液，毒素降解活性最高，为85.50%。发酵上清也具有较高的降解活性，作用24 h降解率达到64.89%，最大降解率为80.62%，每个时间点检测值与菌体发酵液效果均差异不显著（P＞0.05），且最高的降解率均出现在48 h。而菌悬液和胞内液的降解活性相对较低，其中胞内液最高为10.67%，菌悬液为14.32%，且菌悬液和胞内液各个时间点的检测值均差异不显著 （P＞0.05）。因此，SG16降解AFB1的活性物质主要存在于发酵上清，属于细胞外物质。

图3 SG16菌株培养液、菌悬液、胞内液及发酵上清对AFB1的降解率

2.3 不同发酵时间SG16的毒素降解率 由图4所示，发酵时间24 h，降解率最低为24.36%，随着发酵时间的延长，浓缩发酵液的AFB1降解率呈上升趋势，发酵时间60 h，降解率为88.74%，继续延长发酵时间，降解率有所上升（培养72 h，降解率91.23%），但差异不显著（P＞0.05）。本研究中SG16的发酵体系，均采用5%接种量，发酵过程中产物浓度主要与发酵时间相关，且降解率与发酵时间呈现正相关。另外，发酵60 h的降解率与72 h降解率差异不显著，因此SG16菌株的最适发酵周期为60 h。

图4 不同发酵时间SG16的毒素降解率

2.4 不同环境温度条件下SG16发酵液的毒素降解率 温度条件能够影响SG16菌株的毒素降解活性 （图5），浓缩发酵液的毒素降解率在37°C时最高为90.56%，35、40°C降解率均有所降低，但差异不显著，表明SG16的毒素降解活性物质在35～40°C，均能表现较高的活性。升高和降低温度，降解率均出现显著降低（P＜0.05）。温度为20°C降解率降为43.35%；50°C降解率为52.68%。

图5 不同温度条件下SG16的毒素降解率

2.5 不同pH条件下SG16发酵液的毒素降解率利用缓冲液制备不同pH的反应液，通过加入相同浓度的浓缩发酵液，进行毒素降解活性的测定（图6）。结果显示，pH值能够影响SG16的毒素降解活性。pH约为7.5时，降解率最高为89.64%，且随着pH上升和下降，降解率均出现降低的趋势。

图6 不同pH条件下SG16的毒素降解率

2.6 金属离子及蛋白酶K对SG16菌株降解AFB1的影响 本研究选用的金属离子对SG16的毒素降解活性均表现抑制作用，其中Gu2+抑制最强，浓缩发酵液降解率为43.40%，Mg2+的抑制作用最弱，处理后降解率为73.66%，显著低于对照（90.21%），其他金属离子的抑制作用均无显著差异（P＞0.05）（图7）。蛋白酶K处理后，浓缩发酵上清的降解率为28.34%，显著高于金属离子的抑制作用。因此，结合温度、pH对SG16毒素降解率的影响，本研究获得的SG16菌株发酵上清中降解AFB1活性物质推测是一种（类）胞外酶，降解反应可能是一类酶促反应。

图7 金属离子及蛋白酶K对SG16毒素降解率的影响

2.7 浓缩发酵液对玉米中AFB1的降解率 霉变的玉米颗粒经SG16浓缩发酵液处理，AFB1含量由69.5μg/kg降低为13.2μg/kg，低于国家玉米作物中AFB1的限量，降低率达到81.0%。

3 讨论

黄曲霉毒素主要通过污染粮食作物，进而危害畜禽和人类健康。因此，针对黄曲霉毒素降解菌的筛选，除了降解效率之外，菌种的安全性和应用性也是重要的筛选标准。土壤中含有丰富的微生物资源，特别是毒素污染物富集的土壤，成为筛选毒素降解菌的主要来源（李超波等，2012）。本研究以动物粪便以及粪便堆肥土壤为材料，共筛选出6株具有AFB1降解潜力的菌株，其中3株来源于动物粪便，3株来源于粪便堆肥的土壤，研究表明堆肥土壤来源的菌株SG16对AFB1降解活性最强为85.50%，并初步确定为解淀粉芽孢杆菌。

解淀粉芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，与枯草芽孢杆菌亲缘关系较高，具有好氧、环境友好、对畜禽及人类无毒等特点，在生长过程中能够产生一系列显著抑制病原真菌和细菌生长的代谢产物（张娟等，2014）。特别是从动物粪便及肠道内容物中分离的芽孢杆菌作为新型的益生菌添加剂具有广泛的应用前景。本研究筛选的SG16菌株来源于猪牛粪便堆肥的土壤，且被确定为一株解淀粉芽孢杆菌，进一步的结果显示，SG16全发酵液、菌悬液、胞内液以及发酵上清对AFB1的降解率不同，发酵上清液最高为80.62%，与全发酵液差异不显著，菌悬液和胞内液的降解活性较低，证明SG16的降解活性物质主要存在于发酵上清，属于胞外物质。这与孙玲玉等（2014）从泰山土壤中分离的有效降解AFB1的泰山枯草芽孢杆菌的结果一致。另外，对SG16发酵上清液的热稳定性和pH耐受性的检测发现，浓缩发酵液在pH为7.5，毒素降解率最高为89.64%，且随着pH上升和下降，降解率均出现降低的趋势。温度为37°C时降解率最高为90.56%，35、40°C降解率均有所降低，但差异不显著，升高和降低温度，降解率均出现显著降低（P＜0.05）。因此，本研究筛选获得的SG16菌株AFB1降解活性物质的最适pH为7.5，且在35～40°C时，均能表现较高的降解活性，证明SG16发酵液具有较高的实际应用潜力。

本研究中SG16浓缩发酵液经金属离子和蛋白酶K处理后，毒素降解率降低，且蛋白酶K处理组降解率为28.34%，显著低于对照，表明SG16产生的毒素降解物质可能是一种或一类胞外酶。Guan 等（2008）的研究发现，Cu2+和 Zn2+能够显著抑制AFB1毒素降解酶蛋白的活性，而Mg2+能够激活酶的活性。李超波等（2012）从金毛羚牛粪便中分离的一株假单胞菌属菌株，其AFB1降解物质被证明为胞内酶，同样Cu2+能够显著抑制酶蛋白活性，Mg2+能够增强酶活。而本研究中，浓缩发酵液在不同金属离子处理后，毒素降解活性均被抑制，Mg2+的抑制作用最弱，毒素降解率为73.66%，但也显著低于对照（降解率90.21%），其原因可能是菌种的差异，以及降解酶的来源不同导致的。

为了提高SG16的应用价值，本研究采用浓缩发酵液直接处理霉变的玉米颗粒，AFB1降低率达到81.0%，含量由69.5μg/kg降低为13.2μg/kg，低于国家标准中玉米作物AFB1的限量。通过简单的发酵和浓缩，SG16能够表现出显著的毒素降解活性，这为实际生产的应用提供依据。

4 结论

本研究从动物粪便堆肥土壤中分离到一株能高效降解AFB1的细菌SG16，其浓缩发酵液对AFB1标准物的降解率达到90%以上，初步确定为解淀粉芽孢杆菌。SG16菌株产生的毒素降解活性物质主要在发酵上清液，可能是一种胞外酶，且能有效降解玉米中的AFB1。