急性髓系白血病基因危险度分层的临床研究

董颖 张雄 龚燕玲 古茂群 曾权祥

[摘要]目的 检测急性髓系白血病（AML）患者Fms样酪氨酸激酶3（FLT3）、核磷蛋白1（NPM1）、Ⅲ型酪氨酸激酶（C-KIT）及髓系转录因子CCAAT增强子结合蛋白-a（CEBPA）基因表达情况，探讨基因突变者临床特征。方法 选取2015年4月～2017年4月我院的80例AML患者，检测骨髓染色体核型及基因突变情况，比较各基因突变患者的临床特征及预后相关指标。结果 80例AML患者中，染色体核型正常占比43.75%，异常占比56.25%；FLT3-ITD、NPM1、C-KIT-D861V、CEBPA基因突变阳性检出率分别为15.00%、17.50%、7.50%、8.75%，对应正常核型中检出率分别为25.71%、28.57%、0.00%、20.00%；FLT3-ITD基因突变阳性组骨髓原始细胞比例显著高于FLT3-ITD基因突变阴性组（P<0.05），而血红蛋白（Hb）浓度、免疫表型CD117及人类白细胞抗原DR（HLA-DR）表达阳性差异无统计学意义（P>0.05）；NPM1基因突变、C-KIT-D861V基因突变阳性组与阴性组的骨髓原始细胞比例、Hb浓度、免疫表型CD117及HLA-DR表达阳性率差异均无统计学意义（P>0.05）；CEBPA基因双突变的Hb浓度显著高于阴性组（P<0.05），而骨髓原始细胞比例、免疫表型CD117及HLA-DR表达阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）；FLT3-ITD突变阳性组的完全缓解（CR）率、1年无病生存（DFS）率及1年內总生存（OS）率均显著低于阴性组（P<0.05），NPM1突变、C-KIT-D861V突变、CEBPA双突变阳性组与阴性组在CR率、DFS率比较差异无统计学意义（P>0.05），但NPM1突变、CEBPA双突变阳性组的OS率显著高于阴性组（P<0.05），C-KIT-D861V突变阳性组的OS率显著低于阴性组（P<0.05）。结论 AML患者FLT3、NPM1、C-KIT、CEBPA不同基因突变者显示出一定程度不同临床特征，FLT3、C-KIT基因突变者预后不良，NPM1、CEBPA基因突变者预后良好。

[关键词]急性髓系白血病；Fms样酪氨酸激酶3基因；核磷蛋白1基因；Ⅲ型酪氨酸激酶基因；髓系转录因子CCAAT增强子结合蛋白-a基因；基因突变

[中图分类号] R551.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）11（a）-0007-04

Clinical study of gene risk stratification in acute myeloid leukemia

DONG Ying ZHANG Xiong GONG Yan-ling GU Mao-qun ZENG Quan-xiang

Department of Hematology， Maoming People′s Hospital， Guangdong Province， Maoming 525000， China

[Abstract] Objective To detect the expression of Fms-like tyrosine 3 （FLT3）， nucleophosmin 1 （NPM1）， type Ⅲ tyrosine kinase （C-KIT） and myeloid transcription factor CCAAT enhancer binding protein-a （CEBPA） genes in patients with acute myeloid leukemia （AML） and to explore the clinical features of gene mutations. Methods A total of 80 cases of AML patients in our hospital from April 2015 to April 2017 were selected， and the bone marrow karyotype and gene mutations were detected， and the clinical features and prognosis-related indexes of each gene mutation were compared. Results Among 80 AML patients， the proportion of normal karyotype was 43.75%， and the proportion of abnormal karyotype was 56.25%. The positive detection rates of FLT3-ITD， NPM1， C-KIT-D861V and CEBPA mutations were 15.00%， 17.50%， 7.50% and 8.75% respectively， and the detection rates of corresponding normal karyotype were 25.71%， 28.57%， 0.00% and 20.00% respectively. The proportion of bone marrow blasts in FLT3-ITD positive mutation group was significantly higher than that in FLT3-ITD negative mutation group （P<0.05）， but there was no statistically significant difference in hemoglobin （Hb） concentration， immunophenotype CD117 and human leukocyte antigen DR （HLA-DR） positive expression （P>0.05）. There was no significant difference in proportion of bone marrow blasts， Hb concentration， immunophenotype CD117 and HLA-DR positive expression rate between the positive group and the negative group of NPM1 mutation and C-KIT-D861V mutation （P>0.05）. The Hb concentration of double mutation of CEBPA gene of the positive group was significantly higher than that of the negative group （P<0.05）， and there was no significant difference in proportion of bone marrow blasts， immunophenotype CD117 and HLA-DR positive expression rate （P>0.05）. The complete remission （CR） rate， 1-year disease-free survival （DFS） rate and overall survival （OS） rate in the FLT3-ITD positive mutation group were significantly lower than those in the negative group （P<0.05）. The difference was not statistically significant in CR rate and DFS rate between the positive group and the negative group of NPM1 mutation， C-KIT-D861V mutation and CEBPA double mutation （P>0.05）， but the OS rate of the NPM1 mutation and CEBPA double mutation positive group was significantly higher than that of the negative group （P<0.05）， and the OS rate of the C-KIT-D861V positive mutation group was significantly lower than that of the negative group （P<0.05）. Conclusion Different mutations of FLT3， NPM1， C-KIT and CEBPA in AML patients show a certain degree of different clinical features. Patients with FLT3 and C-KIT mutations have poor prognosis， and patients with NPM1 and CEBPA mutations have good prognosis.

[Key words] Acute myeloid leukemia； Fms-like tyrosine 3； Nucleophosmin 1； Type Ⅲ tyrosine kinase； Myeloid transcription factor CCAAT enhancer binding protein-a； Gene mutations

急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）指来源于造血系统髓系原始细胞恶性增殖的急性白血病，与造血前体细胞基因突变关联密切[1]。细胞遗传学异常及基因突变在AML诊断、危险分层、预后评估中具有重要意义，临床上，约55% AML患者可检测出染色体异常，40%～50% AML患者染色体核型正常，可进行基因检测进一步分层[2]。随着学界对基因与疾病关系认识的深入、基因测序技术及比较基因组学等技术发展，研究者发现，AML患者中可鉴别出多种异常基因，基因检测对AML患者诊断、分型及治疗均有重要指导意义[3]。美国国立综合癌症网络（NCCN）指南中明确指出Fms样酪氨酸激酶3（FLT3）、核磷蛋白1（NPM1）、Ⅲ型酪氨酸激酶（C-KIT）及髓系转录因子CCAAT增强子结合蛋白-A（CEBPA）基因突变与AML危险度分层及预后的关系[4]。本研究通过对AML患者四项突变基因进行检测，对患者预后进行分层，旨在为临床个性化治疗提供依据。

1资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年4月～2017年4月我院血液内科收治的80例AML患者作为研究对象。纳入标准：符合WHO（2016）造血和淋巴组织肿瘤分类[5]中AML诊断标准，年龄18～75岁，入院前未接受治疗，对检查、治疗及研究均知情同意。排除标准：合并胃癌、结肠癌等其他恶性肿瘤，治疗不配合或放弃治疗者。80例AML患者中，男44例，女36例；年龄22～75岁，中位年龄52岁；根据英法美协作组（FAB）分型[6]，M1型8例，M2型26例，M3型19例，M4型8例，M5型16例，M6型3例。

1.2方法

采集患者骨髓标本，通过骨髓涂片，检测患者骨髓原始细胞比例；经过抗凝、低渗处理、细胞接种、培养、固定、制片等程序，分析染色体核型；经过抗凝、荧光标记、避光孵育、离心、固定等程序，采用流式细胞仪及相关应用软件，分析髓系祖细胞抗原CD117及人类白细胞抗原DR（HLA-DR）表达情况；采用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增FLT3、NPM1、C-KIT及CEBPA基因，检测基因突变表达；采用毛细管电泳法，通过基因测序仪对突变基因产物进行序列分析，了解各突变基因在AML患者中占比情况。治疗方法参考成人AML中国诊疗指南[7]，根据年龄、预后等级等给予相应治疗方案及监测。

1.3观察指标

统计纳入患者染色体核型及基因突变检测结果，比较不同基因突变阳性组和阴性组骨髓原始细胞比例、血红蛋白（Hb）水平、CD117级HLA-DR表达水平、染色体核型等临床特征。观察不同基因突变组一个标准剂量化疗后的完全缓解（CR）率、1年无病生存（DFS）率及1年内总生存（OS）率，其中所有症状、体征完全消失至少4周视为CR，CR到复发时间≥1年视为1年內DFS，初诊到死亡时间≥1年视为1年内OS[8]。

1.4统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验和方差分析，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1染色体核型及基因突变检测结果分析

80例AML患者中，染色体核型正常者35例（43.75%），染色体核型异常45例（56.25%）；FLT3-ITD基因突变阳性检出共12例（15.00%），其中正常核型中检出率为25.71%，显著高于异常核型中的6.67%（P<0.05）；NPM1基因突变阳性者检出14例（17.50%），其中正常核型中检出率为28.57%，显著高于异常核型中的8.89%（P<0.05）；C-KIT-D861V基因突变阳性检出数6例（7.50%），其中正常核型中检出率为0.00%，显著低于异常核型中的7.50%（P<0.05）；CEBPA基因双突变阳性检出数7例（8.75%），其中正常核型中检出率为20.00%，显著高于异常核型中的0.00%（P<0.05）（表1）。

2.2 FLT3-ITD基因突变阳性组与阴性组临床特征的比较

FLT3-ITD基因突变阳性组的骨髓原始细胞比例显著高于FLT3-ITD基因突变阴性组（P<0.05），而Hb浓度、免疫表型CD117及HLA-DR表达阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

2.3 NPM1基因突变阳性组与阴性组临床特征的比较

NPM1基因突变阳性组与阴性组的骨髓原始细胞比例、Hb浓度、免疫表型CD117及HLA-DR表达阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表3）。

2.4 C-KIT-D861V基因突变阳性组与阴性组临床特征的比较

C-KIT-D861V基因突变阳性组与阴性组的骨髓原始细胞比例、Hb浓度、免疫表型CD117及HLA-DR表达阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表4）。

2.5 CEBPA基因双突变阳性组与阴性组临床特征的比较

CEBPA基因双突变阳性组的Hb浓度显著高于阴性组（P<0.05），而骨髓原始细胞比例、免疫表型CD117及HLA-DR表达阳性率的比较差异无统计学意义（P>0.05）（表5）。

2.6不同基因突变组预后相关指标的比较

FLT3-ITD突变阳性组的CR率、DFS率及OS率均显著低于阴性组（P<0.05），NPM1突变阳性组与阴性组、C-KIT-D861V突变阳性组与阴性组、CEBPA双突变阳性组与阴性组的CR率、DFS率比较差异无统计学意义（P>0.05），但NPM1突变阳性组的OS率显著高于阴性组（P<0.05），C-KIT-D861V突变阳性组的OS率显著低于阴性组（P<0.05），CEBPA双突变阳性组的OS率显著高于阴性组（P<0.05）（表6）。

3讨论

FLT3基因位于13号染色体长臂，在定向造血干细胞表面优先表达，与造血、免疫系统发育关联紧密，与其配体（FL）结合产物可激活多种细胞信号通路，调控造血细胞增殖及分化。FLT3内部串联重复序列（FLT3-ITD）是常见突变类型，其表达产物可引起非依赖配体磷酸化，通过激活多种信号途径，赋予细胞增殖或存活优势，可造成AML复发与难治[9-10]。NPM1主要定位于细胞核仁中，其表达蛋白参与中心体复制、DNA修复、胞核糖体合成及细胞凋亡等过程，在多种恶性肿瘤细胞中过表达。研究显示，NPM1基因突变的AML患者对化疗更敏感，预后较好[11-12]。C-KIT是Ⅲ型酪氨酸激酶家族成员之一，其基因定位于染色体4q12-13，配体为干细胞因子，可参与调控细胞增殖、分化及凋亡，C-KIT-D861V基因突变多发生于异常染色体核型中，可导致C-KIT受体持续激活，激活下游信号转导，造成细胞恶性增殖，可增加AML患者复发风险，是预后不良指标之一[13-14]。CEBPA基因位于19号染色体长臂，在造血系统里仅于髓系细胞中表达，其编码产物为一种维持造血系统粒系分化转录因子，参与调控细胞增殖与分化平衡，其基因突变有单突变及双突变，单突变对预后影响存在争议，而双突变被划分为预后良好指标[15-16]。

染色体核型对AML患者有独立预后价值[17]，本研究对80例AML患者基因检测发现，80例AML患者中，染色体核型正常占比43.75%，染色体核型异常占比56.25%，与文献报道的结果类似[18]。FLT3-ITD、NPM1、CEBPA基因突变多见于正常核型中，C-KIT基因突变主要发生于异常核型，本研究FLT3-ITD基因突变阳性检出率15.00%，正常核型中检出率25.71%，NPM1基因突变阳性者检出率17.50%，正常核型中检出率28.57%，C-KIT-D861V基因突变阳性检出率7.50%，正常核型中检出率0.00%，CEBPA基因双突变阳性检出率8.75%，正常核型中检出率20.00%；与杜雅哲等[19-20]的报道类似。FLT3-ITD突变AML患者的骨髓原始细胞比例较高，CEBPA基因双突变Hb水平较高[19]，与本研究结果显示的FLT3-ITD基因突变阳性组骨髓原始细胞比例高于阴性组，CEBPA基因双突变阳性组Hb浓度显著高于阴性组研究结果一致；NPM1基因突变、C-KIT-D861V基因突变阳性组与阴性组在骨髓原始细胞比例、Hb浓度、免疫表型CD117及HLA-DR表达阳性率均未见明显差异，与报道[20]中NPM1突变者CD117低表达等结果有一定出入，可能与研究样本有关。另外，本研究显示FLT3-ITD突变阳性组CR率、DFS率及OS率均低于阴性组，C-KIT-D861V突变阳性组OS率显著低于阴性组，NPM1突变、CEBPA双突变阳性组OS率显著高于阴性组，与报道[3，10]中的FLT3-ITD突变、C-KIT-D861V突变预后不良，而NPM1突变、CEBPA双突变预后良好等结果类似。

综上所述，AML患者存在基因突变情况，不同基因突变患者在临床特征上有一定差异，NPM1突变、CEBPA双突变可作为预后良好指标，FLT3-ITD突变、C-KIT-D861V可作为预后不良指标，通过检查四项基因突变情况，可以为临床预后判断及治疗提供参考。

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（收稿日期：2018-06-12 本文编辑：祁海文）