STR 分析中两种采血方法的比较

付杰文，成竞梁，邵鳞钫，邵鳞钧，郑小莉，何 涛，傅俊江

（西南医科大学：1医学基础研究中心；2司法鉴定中心，四川泸州 646000）

随着法庭科学及检测检验机构对资质认定的要求越来越高，对短串联重复序列（short tandem repeats,STR）分析图谱质量要求也日益提高。STR是一个小的DNA片段，具有2～6个碱基对重复序列，在编码和非编码区域，分散在整个人类基因组中，占约3%。而现在STR指纹识别或DNA指纹识别可用于个体识别即亲子鉴定。从最初选择单一的一个STR基因座进行PCR扩增及电泳分析比对从而得出结果，到现在需要十几个甚至二十几个STR基因座进行复合扩增，进行电泳和测序图谱分析，最后才能确定亲缘关系[1]。对应当前法医物证检案与DNA数据库建设的需求[2-4]，一些免提取的直接扩增试剂盒已研发和应用，既可以达到快速高效的PCR扩增目的[5]，又可以省下直接提取血液中DNA的时间和成本，而AGCU Expressmarker 22试剂盒就是其中的一种。该试剂盒采用五色荧光标记、多重复合扩增方法，对人基因组DNA中STR基因座的多态性进行检测，可以进行22个基因座的同步扩增和检测[6-7]。现在的STR结果不仅需要测序图谱质量很好，还需要所有不同颜色荧光标记的STR峰的平衡性好，从而增加分析结果的可信性。使用不同的采血方法采集、提取和保存血样，由于对血样中的DNA保护不同，最终会影响到测序结果和图谱质量的好坏[8-10]。为此，采血方法不同对实验结果可能有不同的影响。本文研究是通过使用两种不同的采血方法进行样本采集和保存，然后直接PCR扩增、电泳检测和软件分析所获得的图谱进行比较，探讨两种不同采血方法的优劣性，用于指导我们的实践工作。

1 材料与方法

1.1 材料和设备

样本采集卡FTA血卡购自山东成武荣华生物科技有限公司，普通滤纸购自抚顺市滤纸厂。AGCU Expressmarker 22试剂盒（简称EX22试剂盒）（无锡中德美联生物有限技术公司）[5]，台式离心机（Thermo SCIENTIFIC），直径大小为1 mm提取DNA的法医用打孔器(广州浩源科技有限公司），Veriti®热循环仪PCR和3500 DX基因分析仪均为美国ABI公司产品。

1.2 方法

1.2.1 血液采取

酒精棉球对被鉴定人或正常人进行指尖常规消毒处理后，用FTA血卡或者普通滤纸采集2～4滴黄豆大小的血迹、自然阴凉干燥；注明被鉴定人的信息、编号，并由当事人亲自签字确认后，室温运输和保存，或者直接用于下一步的实验。

1.2.2 直接PCR扩增

用于直接PCR扩增的反应体系为10 μL，包括Reaction Mix 4 μL，EX22 Primers 2 μL，热启动C-Taq酶 0.4 μL，ddH2O 2.6 μL[7,11-12]。取法医用打孔器取2片1 mm孔径滤纸片或FTA卡片作为模板。PCR程序：95℃预变性2 min；94℃变性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共10个循环；90℃预变性30 s，58℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，共20个循环；72℃终延伸10 min；4℃保存。

1.2.3 电泳测序及STR数据分析

将上述PCR扩增产物2.5 μL与10 μL的上样混合物（AGCU Marker SIZ-500 30 μL+去离子甲酰胺1 000 μL）混合，短暂离心，PCR变性5 min，然后使其温度降至室温，再使用ABI 3500 DX基因分析仪电泳测序检测，最后采用GeneMapper ID-X分析软件对生成的原始文件进行STR分析。

2 结果

2.1 使用滤纸片和EX22试剂盒直接PCR的结果

应用滤纸片进行直接PCR扩增和电泳分析，所有产物的各基因座均可获得STR分型（图1），图谱显示出10个STR座的STR峰的平衡性不好，基因座不同等位基因的峰面积差异超过30%，代表PCR扩增不平衡。而个别STR基因座峰的峰高太低，图谱结果不太明显，代表扩增时模板量过少，DNA模板降解而造成这样的结果。代表性结果如图1所示。此外，图1中个别纯合子峰值过低，如D16S539(黄色)。

2.2 使用FTA卡片和EX22试剂盒直接PCR的结果

应用FTA卡片进行直接PCR扩增和分型，STR分型图谱清晰、准确（图2），且所有被不同颜色荧光标记的STR基因座峰高平衡性好，所有的STR基因座之间不同等位基因的峰面积差异都在30%以内。

2.3 两种方法所得结果的比较分析

为了研究所得分析结果是否具有统计学意义，FTA卡片和滤纸片采集的随机样本各使用20个，共40个样本。进行直接PCR扩增，电泳检测，再使用GeneMapper ID-X软件分析STR图谱，得出以下的汇总结果（表1）。STR绿色代表位点间峰高均衡性好，基因座不同等位基因的峰面积差异都在30%以内；STR灰色代表的是工作人员修改过的数据结果，大部分都是因为出现杂峰然后删除导致的；STR黄色代表的是位点间峰高不均衡，基因座不同等位基因的峰面积差异都超出30%，说明PCR扩增不平衡。通过2种方法所得结果的比较分析，结果显示，用滤纸片采血进行常规直接PCR扩增的结果明显差于FTA卡片采血进行常规直接PCR扩增的结果（灰黄的纸、卡比值为3.961 538）。

图1 使用滤纸片和EX22试剂盒直接扩增毛细管电泳代表性结果

图2 使用FTA卡片和EX22试剂盒直接扩增毛细管电泳代表性结果

表1 2种血样采集方法的比较分析

3 讨 论

用于遗传分析的样本，它们被采集和提取DNA方法有许多种[7-8,13-15]，本实验研究显示的是使用不同的采血方法，进行同一种荧光扩增试剂盒（AGCU Expressmarker 22试剂盒）[16-17]直接PCR扩增，且PCR扩增反应体系和程序都相同。而在常染色体STR图谱分析中，良好的复合扩增体系，各基因座的片段峰信号强度应比较接近。且纯合子STR基因座扩增峰的峰高和面积均比杂合子高，而杂合子中的两个等位基因峰高和面积相接近。经过分析STR基因座图谱各位点间峰的平衡性得出，常规直接扩增使用FTA卡片得到的结果明显好于使用滤纸片得到的结果。分析其主要原因是因为FTA是一种特制的滤纸，它由专利配方的强力变性剂和螯合剂浸泡，纤维基质上含有特殊的化学物质，当该特制滤纸捕捉到细胞后自动将其裂解，并与核酸结合，维持样品中DNA的完整性，保护核酸免于降解，免受核酸酶、氧化剂和紫外线等损坏，还能够阻止细菌和其他微生物的生长，对样品中的DNA起到很好的保护作用，并有利于室温运输和长期保存。而滤纸片只是普通的滤纸，其上的样品中的DNA并没有受到任何保护，因此很容易受到各种因素降解[18]，例如：生物因素，有DNA酶等；物理因素，有紫外线等；化学因素，有强酸强碱等；以及环境因素，气温和空气干湿度，例如四川泸州，天气湿热，不利于样本的常规室温保存。有时还会受到细菌和其他微生物的污染，使所得结果没有可信性。当然，FTA卡可能含有抑制PCR扩增的成分，但是经过我们的对比实验证明，这种抑制因素远小于它的优点，能够成功应用于我们的法医物证和亲子鉴定。

4 结 论

FTA卡片能对样品中DNA起到很好的保护作用，常规直接PCR中使用FTA卡片得到的结果明显好于使用滤纸片得到的结果，说明采血时使用FTA卡片明显好于滤纸片。从而使得结果更具有可靠性，有利于指导我们的实践工作。当然，使用FTA卡片直接PCR也无法保证每一种荧光标记的STR峰的平衡性好，说明该实验操作技术还有可改进余地，以提高图谱的质量，增加其可靠性。