mtDNA拷贝数调控MDSCs-IPCs合成及胰岛素释放

胰岛素是机体内一种内源性激素，也是唯一的能降低血糖浓度的激素。而糖尿病是一种常见的代谢性疾病，长期高血糖患者的脏器组织容易产生功能性障碍，胰岛素分泌缺陷是导致糖尿病患者发病的常见原因，改善糖尿病患者胰岛素分泌水平是胰岛素缺陷的治疗方向。mtDNA是线粒体中携带遗传信息的结构，而甲基化是真核生物细胞的基因修饰的常见形式，能够影响基因的转录活性[1-3]。有研究发现细胞中mtDNA拷贝数与糖尿病患者体内的胰岛素分泌量、胰岛素的敏感性和脂肪氧化速率呈现正相关的关系。另外，也有研究证实骨骼肌卫星细胞（MDSCs）在适当条件下能够分化胰岛素分泌细胞（IPCs）[4]。为研究mtDNA拷贝数调控MDSCs-IPCs合成及释放胰岛素的机理，进行以下研究。

1 对象和方法

1.1 对象

健康SPF级SD大鼠，1只，雄性，体质量273 g，由自己医院饲养的实验动物有限责任公司提供，动物许可证号为内蒙古大学，编号scxk[蒙]2016-0001，饲养于动物实验研究中心屏障系统内（普通环境+lvc），温湿度恒定，昼夜光线恒定、节律12/12，自由饮食、进水。

1.2 方法

收集‘大鼠’MDSCs，分为对照组和诱导组，分别于0 h、3 h、6 h、12 h和24 h以及2 d、3 d、7 d和12 d收集并观察细胞，采用TaqMan探针法检测不同时期细胞中mtDNA拷贝数[5-7]；将EtBr处理前后的细胞诱导为胰岛素分泌细胞（IPCs），分析两组细胞诱导分化成IPCs的数量差异[8-10]；检测GSK-3β、sFRP、TCF/LEF及insulin、C-peptide的表达及甲基化差异情况，讨论mtDNA拷贝数影响胰岛素转化的机制。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0软件对数据进行分析处理，计量资料以（均数±标准差）表示，采用t检验；以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Wnt/β-catenin通路的相关蛋白表达和甲基化对比

观察两组细胞结构，发现经过EtBr诱导的诱导组细胞涨满，每毫升样品中mtDNA拷贝数相对于对照组细胞明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 两组诱导分化成IPCs的数量对比

基因选择性表达，细胞会产生分化。经过诱导处理，改变细胞分化条件，能够加速分化过程。两组分化成IPCs的数量占各自样品细胞数量的（87.65±1.50）%和（37.93±1.85）%，诱导组的诱导分化率少于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 Wnt/β-catenin通路的相关蛋白表达和甲基化对比

表1 两组细胞mtDNA拷贝数变化对比（±s）

表1 两组细胞mtDNA拷贝数变化对比（±s）

0 h 0.64±0.13 0.33±0.18 7.341 0.002 3 h 1.85±0.15 1.39±0.20 8.452 0.001 6 h 2.56±0.96 1.53±0.69 6.341 0.008 12 h 13.85±2.33 3.64±3.36 5.577 0.011 24 h 36.43±3.64 8.54±4.52 7.345 0.003 2 d 56.25±7.52 15.41±2.73 4.787 0.033 3 d 111.73±4.16 26.67±1.03 5.936 0.031 7 d 227.45±6.25 43.14±3.52 16.948 ＜0.001 12 d 396.21±4.26 62.15±7.33 19.362 ＜0.001

Wnt通路是Wnt基因调控的信号传递通路，由多种蛋白、受体及酶等组成。对照组的GSK-3β、TCF/LEF表达率小于诱导组，差异具有统计学意义（P＜0.05），而sFRP、insulin和C-peptide表达率大于诱导组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

3 讨论

儿童和青少年人群容易患有1型糖尿病，病情发作时反应剧烈、患者容易产生酮症酸中毒情况。这种疾病是由于患者体内胰岛素异常减少导致，临床治疗时，也是非常依赖胰岛素治疗[11]。但是临床上某些患者注射非自身分泌的胰岛素后容易出现胰岛素过敏症状，特别是在注射非纯化胰岛素或动物胰岛素治疗时，产生斑丘疹瘙痒等局部过敏或过敏性紫癜及荨麻疹等全身性过敏症状，个别患者还可能在注射胰岛素治疗后出现休克等危险现象。除此以外，即使没有在治疗过程中出现胰岛素过敏现象，也很有可能因为长期注射胰岛素造成腹部肥胖、胰岛素水肿、低血糖反应、或者皮下脂肪营养不足等不良反应。另外，国内由于糖尿病治疗的成功控制率不高、社会舆论和部分内分泌医师重视不够，现在临床有出现“心理性胰岛素抵抗”情况，即患者病情及身体情况适合接受胰岛素注射治疗，但患者及家属对胰岛素治疗有很强的抗拒心理，比如认为注射胰岛素可能会像使用止痛药、镇静剂甚至是毒品那样，产生身体及心理依赖，遵医行为不好、影响治疗。如果能从基因出发，将患者体内各类干细胞诱导分化成能产生胰岛素有关因子的细胞，能从根本上治疗此类疾病。本研究从mtDNA这类携带基因信息的物质出发，认为mtDNA含量不同会影响核基因的甲基化程度，从而影响基因的功能表达。EtBr可以较为牢固结合mtDNA，抑制其复制，而细胞核DNA等由于有核蛋白保护，不受EtBr影响。经过EtBr处理的细胞的mtDNA复制会受到抑制，mtDNA拷贝数减少[12]。MDSCs有分化成IPCs的潜力。较少mtDNA拷贝数的诱导组的诱导分化成IPCs细胞的比例也明显少于对照组，显示mtDNA拷贝数与MDSCs分化成IPCs的成功率成正相关。关于较多数量mtDNA促进细胞分化成IPCs的生物分子层面原因，有较多经过对Wnt通路的关键有关蛋白分析的先例。本研究认为，mtDNA拷贝数增加，sFRPs增加，竞争性结合Wnt受体，拮抗Wnt信号，β-catenin磷酸化和降解增加，无法在细胞内沉积，不能激活转录因子TCF，从而促进MDSC细胞分化IPC细胞，增加了insulin和C-peptide。通过研究证明了mtDNA拷贝数与MDSC细胞分化呈正相关，通过影响Wnt通路有关蛋白影响胰岛素释放。

综上所述，本研究结果证实，mtDNA拷贝数增加能提高MDSCs-IPCs转化率，mtDNA通过控制增加Wnt通路相关的sFRP，抑制TCF转录因子，促进MDSC细胞分化成IPC细胞，增加insulin和C-peptide生成。

表2 Wnt通路的相关蛋白表达和甲基化（±s，%）

表2 Wnt通路的相关蛋白表达和甲基化（±s，%）

GSK-3β 42.25±3.55 79.23±3.26 7.346 0.002 sFRP 74.24±2.63 53.71±5.72 5.213 0.039 TCF/LEF 32.74±2.63 84.23±2.62 13.325 ＜0.001 insulin 88.23±1.35 43.22±2.64 6.231 0.011 C-peptide 87.34±4.26 39.68±1.04 5.257 0.034