氟西汀对卒中后抑郁模型大鼠的行为及海马神经元新生的影响

李爱平，田 静，周芝文，杨期明，周文胜

(湖南省人民医院神经内科，长沙 410016)

卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是脑卒中后常见的神经精神并发症，其患病率逐年升高[1]，并且至少1/3患者在缺血性脑卒中后会出现心境改变[2]。现代医学认为，PSD是各种神经生物学和社会心理因素综合作用的结果[3-4]。研究发现，抑郁症患者或动物模型存在海马神经元再生减少、海马体积变小，而且抗抑郁药物可以增加海马神经元再生[5]，提示海马神经元的再生障碍可能也参与了PSD的发生。本研究将建立PSD大鼠模型，并观察大鼠的行为学变化及其海马齿状回神经元的新生情况，探索氟西汀对PSD模型大鼠的治疗作用及生物学机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

成年雄性SD大鼠40只(SPF级)，体重240～260 g，购于湖南省斯莱克景达实验动物有限公司[SCXK(湘)2016-0002]，动物实验在湖南省人民医院老年医学研究所动物实验室进行[SYXK(湘)2015-0013]。福利伦理审查号(伦审科2016第006号)，按照实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 主要试剂与仪器

盐酸氟西汀购于大连美仑生物技术有限公司(产品编号：MB1555)。MCAO硅胶栓线购于广州佳灵生物技术有限公司(产品规格：L3600)。微小染色体维持蛋白2抗体(Anti-MCM2 Antibody) 购于武汉博士德生物有限公司(产品编号：BM4086)。

1.3 试验方法

1.3.1 动物分组

在室温(20 ± 2)℃和相对湿度为50% ～ 60%的条件下适应性饲养大鼠一周，大鼠自由进食和饮水，予以人工12 h昼夜循环照明(7:00 ～ 19:00光照)，隔日定时清洁笼舍。期间测定敞箱试验(open field test, OFT)、蔗糖偏爱试验(sucrose preference test, SPT)基线评分。筛选符合条件(OFT基线评分为30～ 120分)的大鼠40只随机分成2组：手术组(n=32)和假手术组(n=8)。手术组行大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)术，术后24 h评分≥1分且<4分(按照Longa等[6]标准)的大鼠24只再随机分成3组：卒中组(n=8)，每笼3～4只饲养；PSD 组(n=8)，MCAO术后第2天加以慢性不可预见温和应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)结合独笼饲养；氟西汀组(n=8)，MCAO术后第2天即开始CMUS刺激结合独笼饲养，自第15天起每日一次腹腔注射氟西汀(剂量为5 mg/kg体重)[7]进行干预，共用药3周。假手术组除不插入栓线外，其他处理同卒中组。

1.3.2 PSD模型建立

首先参照Longa等[6]方法建立永久性MCAO模型，术中参照包新杰等[8]研究结果确定插入栓线深度为(18±1)mm。MCAO术后第2天,参照Willner[9]和Katz[10]报道的CUMS方法给予应激：①禁食禁饮20 h；②禁饮17 h；③45°斜置鼠笼17 h；④持续照明17 h；⑤湿笼(100 g垫料+200 mL水)21 h；⑥4℃水强迫游泳5 min；⑦水平震荡鼠笼5 min；⑧行为约束2 h；⑨夹尾1 min，以上9种应激每天随机采取一种，并采用单笼饲养。

1.3.3 行为学评价

各组大鼠术前基线期(0 d)及术后第7、14、21、28和35天分别测量体重，并进行SPT和OFT，而强迫游泳试验(forced swim test，FST)仅在第35天末次应激后进行。

(1)蔗糖偏爱试验 借鉴Willner等方法[9]加以改进。首先予1%蔗糖水饲养48 h，再禁水4 h，然后暴露1 h于两个完全相同的瓶子(一个盛满1%蔗糖水，另一个盛满普通饮用水)。测定此1 h内蔗糖水消耗体积与总消耗体积(蔗糖水+饮用水)的比值。

(2)敞箱试验 参照Papp等方法[11]所用敞箱长宽均为 80 cm、高为40 cm，内空的立柱体，壁周为黑色，底面用黑线划分为面积相等的25块。以动物穿越地面方块数(四爪跨入)作为水平活动得分，以直立次数(两前肢离地l cm 以上)为垂直活动得分，记录5 min。室内隔音，每次实验后均需将动物排泄物清除干净。

(3)强迫游泳试验 参照Porsolt等方法[12]，试验前1天将大鼠笼敞开饲养，第2天将大鼠放入一个盛水[(24±1)℃，45 cm深]的圆柱状筒内持续10 min，游泳过程用摄像机拍摄记录。观察最初5 min，累计大鼠在水中不动、游动或攀爬状态的时间。

1.3.4 免疫组化

行为学试验结束后，用10%水合氯醛按3 mL/kg体重腹腔注射麻醉大鼠，先后用4℃生理盐水及含1%蔗糖的1%多聚甲醛(PFA)进行灌注，取脑于含1%蔗糖的1%PFA固定3 h，再移入4℃30%蔗糖溶液置冰箱中脱水沉底，制备海马冠状位冰冻切片(厚度20 μm)。取每只大鼠海马组织结构最清楚的3张冰冻切片进行微小染色体维持蛋白2(minichromosome maintenance complex component 2，MCM2)免疫组化染色，在400倍显微镜下，随机选取五个视野，计算每个视野的MCM2阳性细胞数，然后取其平均值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 体重的变化

各组大鼠在术前体重基线值无统计学差异(P>0.05)。在实验观察期内，假手术组大鼠体重随饲养时间延长而缓慢增加，而卒中组、PSD组和氟西汀组大鼠体重在手术后前14天内呈下降趋势，自第21天时开始体重逐渐增加，其中卒中组和氟西汀组大鼠的体重增长速度较PSD组大鼠明显增快。与卒中组比较，PSD组大鼠的体重在第21、28和35天时均有统计学差异(P<0.01)；与PSD组比较，氟西汀组大鼠的体重在第21、28和35天时均有统计学差异(P<0.01)(见表1)。

2.2 蔗糖偏爱试验

各组大鼠蔗糖水消耗比例术前基线水平无统计学差异(P>0.05)；MCAO术后第14、21、28、35天时，与卒中组比较，PSD组大鼠蔗糖水消耗比例均显著减少(P<0.01)；与PSD组比较，氟西汀组大鼠的蔗糖水消耗比例在第21、28和35天时显著增加(P<0.05)(见表2)。

2.3 敞箱试验

各组大鼠术前水平运动评分基线值无统计学差异(P>0.05)；与卒中组比较，PSD组大鼠水平运动得分在第21、28和35天时显著下降(P<0.01)；与PSD组比较，氟西汀干预后大鼠在第21、28和35天时水平运动得分明显增加(P<0.05)(见表3)。

各组大鼠术前垂直运动评分基线值无统计学差异(P>0.05)；与卒中组比较，PSD组大鼠垂直运动得分在第28和35天时明显下降(P<0.05)；与PSD组比较，氟西汀干预后大鼠在第28和35天时垂直运动得分显著增加(P<0.05)(见表4)。

2.4 强迫游泳试验

与假手术组、卒中组比较，PSD组大鼠的不动时间显著增加(P<0.01)，游动及攀爬时间显著缩短(P<0.01)；与PSD组相比，氟西汀干预后大鼠不动时间显著缩短(P<0.01)，游动时间显著增加(P<0.01)(见表5)。

2.5 海马齿状回新生神经元的变化

采用免疫组化方法检测大鼠海马齿状回区MCM2的表达，分析海马中新生神经元增生的变化。结果显示，在大鼠海马结构中，可见MCM2主要表达于细胞核，MCM2阳性细胞局限于颗粒细胞层和门区之间的颗粒细胞下层，一般不会超过颗粒细胞层内1/3(见图1)。与卒中组比较，PSD组大鼠海马齿状回的MCM2阳性细胞数显著减少(H=109.30和P<0.01)；与PSD组比较，氟西汀组大鼠海马齿状回的MCM2阳性细胞数显著增加(H=149.74,P<0.01)(见图2)。

表1 各组大鼠不同时间点的体重变化Table 1 Weight changes of the rats in each group at various time points

注：与PSD组比较，△P<0.05，*P<0.01。

Note. Compared with the PSD group，△P<0.05，*P<0.01.

表2 各组大鼠不同时间点的蔗糖水消耗比例Table 2 Volume ratio of sucrose water consumption of the rats in each group at various time points

注：与PSD组比较，△P<0.05，*P<0.01。

Note. Compared with the PSD group，△P<0.05，*P<0.01.

表3 各组大鼠在敞箱试验中不同时间点的水平运动得分Table 3 Comparisons of horizontal movement scores in the open field test of rats in each group

注：与PSD组比较，△P<0.05，*P<0.01。

Note. Compared with the PSD group，△P<0.05，*P<0.01.

表4 各组大鼠在敞箱试验中不同时间点的垂直运动得分Table 4 Comparisons of vertical movement scores in the open field test of rats in each group

注：与PSD组比较，△P<0.05，*P<0.01。

Note. Compared with the PSD group，△P<0.05，*P<0.01.

注：a：大鼠海马齿状回；b：黑色箭头示MCM2+细胞。图1 大鼠海马齿状回MCM2阳性细胞的表达定位Note. a: Hippocampal dentate gyrus of rats; b: MCM2+ cells (black arrow).Figure 1 Localization of MCM2+ cells in the hippocampal dentate gyrus of rats

组别Groups不动时间(s)Immobility time游动时间(s)Swimming time攀爬时间(s)Climbing time假手术组Control group40.50±7.82*120.25±8.24*139.25±11.55*卒中组Stroke group44.63±10.76*119.38±12.81*136.00±22.30*PSD组PSD group108.63±14.4686.75±10.51104.63±13.42氟西汀组Fluoxetine group50.25±13.09*132.12±16.48*117.63±11.60

注：与PSD组比较，△P<0.05，*P<0.01。

Note. Compared with the PSD group，△P<0.05，*P<0.01.

注：与假手术组比较，#P<0.01；与卒中组比较，△P<0.01；与PSD组比较， ※P<0.01。图2 大鼠海马齿状回MCM2阳性细胞的数量对比Note. Compared with the control group, #P<0.01; compared with the stroke group, △P<0.01; compared with the PSD group, ※P<0.01.Figure 2 Comparisons of MCM2+ cell numbers in the hippocampal dentate gyrus of rats in each group

3 讨论

PSD是脑卒中后出现的一种精神情感障碍，它是卒中后脑部特定功能结构的损伤以及各种心理和社会应激的共同结果。本实验首先通过线栓法制备脑缺血卒中模型，再运用孤养法及CMUS法联合模拟卒中后的负性压力环境制备PSD模型大鼠。该模型广泛应用于PSD发病机制和药物疗效评价研究，其原理是啮齿类动物在经历一系列CMUS应激后，会出现快感缺失、兴趣及运动下降、探索行为下降等抑郁行为特征[13-14]。

体重减轻是CMUS模型大鼠的重要特征之一，其原因可能是由于大鼠情感抑郁、食欲下降导致体重增加缓慢，但也可能是应激过程中采用了禁食禁水刺激，直接导致体重增加缓慢[15]。因此，体重的减轻可以反映应激事件对大鼠的负面影响，但不能作为衡量PSD大鼠模型建立是否成功的标准。SPT是根据大鼠对甜味的偏好而设计的一种检测方法，反映了大鼠体验快乐的能力，常用来评价抑郁大鼠的快感缺失症状[9]。OFT是反映大鼠对未知环境的探索能力及情绪反应的经典实验，主要评价抑郁大鼠对外界的探索行为和好奇心下降等症状[11]。FST通过评估大鼠在游泳中出现的静止不动、游动或攀爬三种状态，反映大鼠的悲观绝望样行为特征[12]。但也有一些学者认为，强迫游泳试验中动物的静止状态可能只是一种适应或疲劳现象，而不是真正的绝望行为[16]。因此，本实验采用体重变化、SPT、OFT和FST等四个指标来综合评估PSD大鼠模型的建立及氟西汀的干预作用。

本实验发现，PSD模型大鼠在CMUS应激后第7、14天时体重下降幅度较卒中组大鼠无统计学差异，但在第21、28和35天时体重的增加较卒中组大鼠明显减慢，提示随着应激事件的累积，PSD模型大鼠的体重增长受到了负面影响，该结果与既往研究报道一致。而与卒中组大鼠比较，PSD模型大鼠的蔗糖水消耗比例(第14、21、28、35天)、OFT中的水平运动得分和垂直运动得分(第28和35天)均显著下降，而且在CMUS后第35天进行的FST显示PSD模型大鼠的不动时间显著延长、游动及攀爬时间显著缩短。以上结果显示，CMUS刺激累积一段时间后，PSD模型大鼠表现出来的抑郁样行为特征越来越显著，也表明PSD大鼠模型建立成功。此外，与PSD组大鼠比较，氟西汀干预后的PSD模型大鼠的体重、蔗糖水消耗比例、水平运动和垂直运动得分、游泳中的不动时间均有明显改善，说明氟西汀能改善PSD模型大鼠的抑郁症状。

MCM2蛋白是一种基因复制相关蛋白，存在于细胞核，是检测海马神经元新生的常用标记物[17]。本实验结果显示，经历MCAO术的大鼠海马齿状回MCM2阳性细胞数明显增加，可能是急性卒中应激诱发了海马神经元新生和重塑；但CMUS联合孤养应激后，大鼠海马齿状回的MCM2阳性细胞数增幅明显下降，并且氟西汀的干预可以部分逆转这种下降趋势。既往研究报道，5-羟色胺1A受体(5-hydroxytryptamine 1A receptor，5-HT1A)能介导5-HT对海马齿状回的神经重塑起促进作用，5-HT缺乏可引起海马齿状回神经发生速度下降，进而促发抑郁[18-19]；PSD患者大脑皮层中5-HT和去甲肾上腺素能(norepinephrine，NE)递质水平降低、边缘系统和中缝核5-HT代谢速度显著减慢、脑脊液中5-HT的代谢产物明显下降[20-22]，PSD模型大鼠的额叶和海马区5-HT和NE含量也明显降低[23-24]，并且使用5-HT和NE再摄取抑制剂对PSD治疗有积极作用[21,24]；也有学者认为，脑卒中相关的炎性细胞因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α等)增多导致脑内5-HT的耗竭，从而导致PSD发生[25]。因此，5-HT及其相关代谢通路在PSD的发病过程中起重要作用。氟西汀是一种选择性5-HT再摄取抑制剂，临床上常作为抗抑郁治疗的一线用药。本实验结果显示，氟西汀可以显著改善PSD模型大鼠的抑郁样行为，并且促进海马齿状回的神经元再生，这与另一种选择性5-HT再摄取抑制剂(艾司西酞普兰)类似[26]，但后者的抗抑郁作用起效更快，可能是因为对海马区神经再生的影响更快[27]。综上所述，海马齿状回的神经再生障碍可能是PSD发病的重要机制之一，同时也可能是氟西汀等抗抑郁药物作用的远隔效应，但其具体机制仍有待从显微形态学、神经营养、信号传导等方面深入研究。