基于Caspase-3研究五子衍宗丸治疗少精子症的疗效及机制

柯明辉 陆 兴 刘保兴 王传航

中日友好医院男科（北京 100029）

由于生活方式和环境发生变化、生育年龄推迟等因素，男性不育的发病率不断增高[1]。大部分不育患者无法找到明确病因，仅表现为精子质量下降，根据临床经验和WHO制定的指导意见[2]，精子总数可以衡量睾丸产生精子的能力，与生育结局关系最密切，因此少精子症最容易导致男性不育。少精子症的病因目前尚不明确，但生精细胞和精子凋亡被认为可能是导致生精障碍的一个原因[3]。中医认为男性不育少精子症的主要病机是肾精亏虚，补肾填精法是基本治法，五子衍宗丸被公认是该治法的代表方药，临床上已取得了较好的疗效，很多治疗不育症的方剂都是以该方为基础方。为了进一步明确五子衍宗丸治疗男性不育少精子症的疗效和机制，笔者设计了以下研究。

资料与方法

一、总体设计

未设立对照组的研究又称单组研究，存在不够严谨、证据等级不高的缺点，但单组研究因为所有受试者都接受同一种药物治疗，具有容易操作、耗费资金少、较快获得结果的优点，对于尚无公认有效治疗药物或共识中无金标准治疗方案的疾病的研究，以及无法找到合适对照药物的疾病的研究，可以考虑使用单组研究设计[4]。目前男性不育治疗药物中，五子衍宗丸是最被认可的药物，常被用作临床研究中的对照药物，因此本研究不设对照组采用单组研究设计。

二、研究对象

研究对象为2015年3月至2016年10月来中日友好医院男科就诊的男性不育少精子症患者50例，均符合肾精亏虚辨证标准。

（一）西医诊断标准

参考世界卫生组织《人类精液分析实验室技术手册》第五版[2]制定了以下标准。

1. 男性不育诊断标准：未采取避孕措施，婚居1年或1年以上配偶未怀孕，并且排除了女方的因素，即可诊断为男性不育。

2. 少精子症的判定标准：（1）精子总数＜39×106，且≥5×106（排除了重度少精子症）；（2）精液量≥1.5mL（排除输精管道梗阻、逆向射精或标本采集不全等）；（3）一周内连续检测2次，均符合诊断标准才能入组，选择精子总数较多的检测结果进行记录。

（二） 中医肾精亏虚证辨证标准

该辨证标准是参考国家中医药管理局的《中医临床诊疗术语》证候部分制定[3]。

1. 主症：精子总数减少、婚后不育；腰膝酸软；精神萎靡。

2. 次症：头晕；耳鸣；健忘；乏力；失眠多梦；足跟疼痛。舌淡苔白，脉沉细弱。 具备主症第一项和其他任意一项主症，同时具备次症2项即可诊断。

（三） 纳入标准

1. 年龄≥20岁且≤59岁。

2. 符合男性不育诊断标准和少精子症判定标准。3. 符合中医肾精亏虚辨证标准。

4. 入选前3个月内未服用任何有生精作用的药物。

5. 签署入组知情同意书。

（四） 排除标准

1. 年龄＜20岁或＞60岁。

2. 工作环境为高温或接触放射线者。

3. 有不良生活习惯，如吸烟、酗酒、吸毒、经常洗桑拿和长期熬夜。

4. 有严重的基础疾病，或先天性生殖系统畸形、重度精索静脉曲张、睾丸附睾炎等。

5. 不符合中医肾精亏虚证辨证标准。

6. 近3个月参与了其他临床试验研究。

7. 近6个月有高热病史（体温＞39℃）。

（五）失访标准

任何原因在第3个月末预约时间点（±7d）未能到诊者。

三、治疗方法

治疗药物五子衍宗丸（同仁堂股份有限责任公司，国药准字Z11020188，15106）具体成分为：枸杞子、菟丝子（炒）、覆盆子、五味子（盐炒）、车前子。具体服药方法为：饭后服用，6g bid。疗程90d。

四、观察内容

（一）精子质量

患者禁欲48h以上7d以内，手淫取精后将全部精液留取到专用无菌杯中，立即放入37℃的恒温水浴箱，待精液标本完全液化后，按照世界卫生组织《人类精液分析实验室技术手册》第5版规定的标准操作流程及方法，用WLJY-9000型计算机辅助精子质量自动分析系统（北京伟力新世纪公司生产）进行精子质量检查。主要记录指标有精液量、精子总数和前向运动精子百分率（%）。

（二）Caspase-3表达

由于经费限制，随机选择8例病例，治疗前和治疗90d后各检测一次精子凋亡率。待测的精液标本-80℃保存，采用Western blot法检测凋亡，使用的主要试剂、抗体、仪器及检测方法如下：

1. 主要试剂、抗体及实验仪器：高速离心机（X I A N G Y I）、多重扫描M K 3酶标仪（hermoVE180）、垂直电泳槽（Tanon）、高电流电泳仪（BioRad）、摇床（Kylin-Bell）、BCA蛋白定量分析试剂盒（Comwin Biotech ，02912E）、聚偏二佛乙烯膜（Merc Millipore，6001）、蛋白酶抑制剂混合物（Roche，0469311）、山羊抗兔IgG-HRP（Jackson，111-035-003）、山羊抗鼠IgGHRP（Jackson，115-035-003）、Caspase-3 抗体（proteintech ，19677-1-AP）。

2. 主要实验步骤：蛋白抽提、定量、上样蛋白制备。配制12%分离胶、5%浓缩胶，上样（15μg/孔），电泳（浓缩胶恒压90V，约20min；分离胶恒压120V），转膜（300mA恒流；0.45μm孔径PVDF膜，时间90min），封闭（浸于5% BSA-TBST，水平摇床中孵育1h），一抗孵育（5% BSA-TBST稀释，4℃水平摇床孵育过夜），次日洗膜（TBST洗3次，每次10min），二抗孵育（5% BSA-TBST稀释二抗，室温孵育 40min），洗膜（TBST洗3次，每次10min），曝光、显影2min、定影。

（三）一般情况

记录年龄、BMI、睾丸平均体积等指标。睾丸体积在超声医生指导下进行测量，计算公式：睾丸体积=上下径×左右径×前后径×0.7，测量出两侧的睾丸体积后，取平均值得出睾丸平均体积。

（四）配偶妊娠情况

临床观察过程中密切进行电话回访，一旦患者回复配偶已经妊娠，立即记录配偶年龄等信息，该病例则可以退出。

五、数据统计与描述

计量资料符合正态分布或近似符合正态分布的采用均数±标准差描述，非正态分布的用中位数±四分位数间距的方式来描述。呈正态分布或近似正态分布的计量资料，采用配对样本的t检验；非正态分布分布的计量资料，采用Wilcoxon符号秩和检验（Wilcoxon Signed-rank test）。数据处理和统计学分析采用SPSS统计软件，以α=0.05为检验水准。

结 果

一、总体完成情况

观察期间，50例中4例因为配偶妊娠，退出临床观察；3例未在预约时间点（±7d）复诊，视为脱落病例。4例配偶妊娠病例均有精子前向运动精子百分率较高、配偶较年轻的特点。

二、治疗前后精子质量变化

治疗后精液量有增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后前向运动精子百分率虽然未达到参考值标准，但显著高于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.01）；治疗后精子总数达到参考值标准，明显比治疗前增多，差异有统计学意义（P＜0.01）。具体结果见表1。

表1 治疗前后精液参数变化

三、分组比较治疗前后精子总数变化

根据既往文献报道和临床经验，患者的一些基本状况可能会影响男性不育的治疗效果。因此，根据年龄、体质量、睾丸体积及精子前向运动精子百分率这4个因素进行分组讨论。具体结果见表2。

（一）根据年龄分组

结果显示20岁～和30岁～组治疗后精子总数均明显比治疗前增多，差异有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）；40岁～组由于病例数过少统计学分析结果不一定可靠，所以采用描述性分析，可以认为治疗后精子总数有增加趋势。

（二）根据体质量分组

正常组（1 8.5≤B M I＜2 5）和超质量组（25≤BMI＜28）治疗后精子总数明显比治疗前增多，差异有统计学意义（P＜0.01）；肥胖组（28≤BMI＜32）由于病例数过少统计学分析结果不一定可靠，所以采用描述性分析，可以认为治疗后精子总数变化不明显，反而略有下降趋势。

表2 分组比较治疗前后精子总数

（三）根据睾丸体积分组

正常组（睾丸体积＞12mL）治疗后精子总数明显比治疗前增多，差异有统计学意义（P＜0.01）；异常组（睾丸体积＜12mL）由于病例数过少统计学分析结果不一定可靠，所以采用描述性分析，可以认为治疗后精子总数有增加趋势。

（四）根据前向运动精子百分率分组

异常组（前向运动百分率＜32%）治疗后精子总数明显比治疗前增多，差异有统计学意义（P＜0.01）；正常组由于病例数过少统计学分析结果不一定可靠，所以采用描述性分析，可以认为治疗后精子总数有增加趋势。

四、治疗前后精子Caspase-3的表达

对治疗前与治疗90d后凋亡指标Caspase-3的表达进行统计分析，治疗前Caspase-3为0.445±0.164，治疗后为0.317±0.122，结果显示治疗后Caspase-3的表达显著低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05），具体结果见图1。

图1 治疗前后Caspase-3表达

讨 论

70%左右的男性不育患者不能找到明确的病因，仅表现为精子总数、活力和形态方面的异常，足够数量的前向运动精子是使配偶受孕的必要条件，因此精子数量减少最容易导致男性不育，然而很少有专门针对少精子症的临床研究，这是本研究的一个亮点。

精子数量减少的具体病因尚不明确，生精细胞和精子过度凋亡被认为可能引起生精障碍。国内外均有研究[6,7]显示不育患者的生精细胞和精子凋亡率显著高于生育力正常的人群，刘媛等[8]进一步研究发现少精子症患者的精子凋亡率显著增高，而弱精子症、畸形精子症患者的精子凋亡率与正常人群无显著差异。干预研究也得出了类似结论，他莫昔芬增加精子数量的原理可能是抑制生精细胞凋亡[9]，五子衍宗丸等补肾填精类中药可以通过抑制生精细胞和精子的凋亡发挥促进生精的作用[10,11]。Caspase-3被公认是细胞凋亡的主要执行者，在凋亡信号传导的多种途径中发挥关键作用[12]，因此在凋亡研究中是常用的观察指标。已有临床研究报道[13]Caspase-3的含量与精子浓度、精子活性均呈负相关；对锰产生生殖毒性的原理进行研究，发现上调生精细胞Caspase-3表达、诱发生精细胞凋亡可能是机制之一[14]；也有关于中药降低Caspase-3表达的报道，王志强等[15]通过体外实验发现，养精胶囊具有抑制精原细胞凋亡，降低其Caspase-3的表达水平的作用。因此本研究也通过Caspase-3的表达变化来观察精子凋亡情况，结果提示下调Caspase-3表达水平可能是五子衍宗丸改善精子数量的机制之一，既往尚无类似的报道。

在疗效方面，观察过程中4例患者配偶成功受孕，提示少精子症患者有一定的自然怀孕概率，对于经济状况较差而且配偶年龄偏小、精子活力较好的患者，可以建议其采取等待疗法。治疗后精子总数、前向运动精子百分率明显改善，尤其是精子总数整体上已经高于参考值标准，但前向运动精子百分率未达到参考值水平，显示五子衍宗丸对精子数量的改善优于活力。中医理论认为“阳化气、阴成形”，精子的数量是有形物质，依赖肾精、肾阴的滋养，而精子的运动能力需要阳气推动，依赖肾阳的温煦推动和帮助气化[16,17]，本研究结果与基础理论符合。基础研究证实补肾法的生物学机制可能是改善性腺、附属性腺的分泌功能[18,19]，因此理论上五子衍宗丸可以增加精液量，但本次研究并未发现治疗后患者的精液量有显著增多，可能精液量与禁欲天数、精神身体状态、是否适应取精环境等均有关系，不是单纯的反映附属性腺的分泌功能。提示在临床上，除了精液量过多或过少的特殊情况，一般不用过于关注精液量的变化，因为精液量的影响因素太多，应该以一次排精的精子总数为准。

将年龄、体质量、睾丸体积、精子活力作为影响疗效的因素来分析，既往尚未出现采用这种方法的临床研究报道。本次研究纳入的病例介于20～51岁之间，在当前的物质条件下，男性如果无基础疾病，其生殖能力可以保持在相对良好的水平，因此本研究未发现年龄会影响治疗效果是可以解释的。肥胖因素被公认可以影响精子质量[20,21]，而本研究也发现肥胖组治疗后精子总数改变并不明显，推测是肥胖因素导致了精子数量减少从而抵消了药物效果，因此在药物治疗的同时，应该嘱咐肥胖者加强锻炼减轻体重以提高疗效。睾丸体积一定程度上可以体现睾丸的生精功能，小睾丸者出现精子数量异常的概率也大于睾丸体积正常者，但入组病例中80%睾丸体积正常，本次观察也并未发现小睾丸组的治疗效果差于睾丸体积正常组，期待以后有大样本的深入研究。既往对精子数量和活力的关系研究甚少，精子数量主要反映睾丸生精上皮的功能，而精子活力主要体现附睾的功能，理论上两者应该没有直接关系，而本研究的入组病例中80%精子活力低，显示少精多数伴有弱精，但并未发现精子活力的差异会影响精子数量的改善程度。

本研究首次基于Caspase-3表达研究五子衍宗丸治疗少精子症的机制，在疗效观察上考虑到了多种可能的影响因素，研究指标和方法均有创新性，对临床有指导意义。然而由于时间和经费的限制，本次研究病例数少，期望以后进行更大样本和多中心的研究。