巴什拜羊A-FABP、PBDC1基因多态性及其与巴什拜羊生长性状的相关分析

热依拉·普拉提，黄李勇，赵 雄，依明·苏来曼*

(1.新疆维吾尔自治区畜牧总站，乌鲁木齐 830001；2.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052）

脂肪型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty-acid binding protein，A-FABP)属于脂肪酸结合蛋白家族。目前研究发现FABPs家族至少包括9种蛋白，且该家族蛋白在细胞脂肪酸代谢及转运中发挥重要作用[1]，在哺乳动物中，A-FABP蛋白主要在脂肪细胞中表达并参与甘油三酯的形成及脂肪沉积[2、3]。A-FABP基因多态性研究表明，鸡[4]、鸭[5]、牛[6]、猪[7]的A-FABP基因多态性与肌内脂肪沉积相关，可作为重要的候选基因进行研究。PBDC1是含有198个氨基酸的多糖生物合成域1蛋白 （polysaccharide biosyn-thesis domain-containing1，PBDC1），分子质量约为22.2 kDa。PBDC1基因位于小鼠染色体上,其全长cDNA为597 bp[8]。前期工作研究发现，在丁酸钠诱导MEL细胞分化的过程中PBDC1的蛋白含量逐渐下调。由此推测PBDC1蛋白可能与诱导的MEL细胞分化有关，而目前，关于PBDC1蛋白在动物中多态性研究较少。鉴于A-FABP和PBDC1基因的功能和作用，将二者作为与生产性状相关的候选基因来研究，对以后的动物分子育种和标记辅助选择具有一定的应用价值。

巴什拜羊是上世纪初期，哈萨克族爱国人士巴什拜·乔拉克·巴平选用哈萨克羊中优秀母羊作为母本，并严格选育优良种公羊，同时导入野生盘羊进行长期的杂交选育而形成的优良地方品种[9]。具有耐寒、适应性强、生长速度快、早熟、肉质鲜美等特点。巴什拜羊原产于裕民县的巴尔鲁克山区[10]，现今主要分布在塔城地区的裕民县、额敏县、塔城市以及托里县。根据2014年统计结果显示塔城地区的巴什拜羊年底存栏总数已达150万只[11]。目前，关于巴什拜羊生长发育性状候选基因的标记辅助选择研究报道较少。本研究对巴什拜羊A-FABP和PBDC1基因进行多态性分析，探讨基因多态性与生长指标的关系，期望为后期巴什拜羊分子育种提供有利的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本选择

在新疆裕民县巴什拜羊繁育基地随机的选取120只年龄1.5岁的纯种巴什拜羊作为试验羊。颈静脉采血5 mL/只，枸橼酸钠抗凝，放于冰盒中带回实验室，-20℃保存备用。

1.1.2 试剂与药品

Tris平衡酚，无水乙醇，70%无水乙醇，2×Taq PCR MasterMix，6×Loading Buffer，核酸提取液，DL2000，ddH2O，蒸馏水，甲醛，30%非变性聚丙烯酰胺，T10E10，T10E1，琼脂糖粉，硝酸银，氢氧化钠等。

1.1.3 试验仪器

电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂；TGL-16M高速台式冷冻离心机：湘仪公司；TGL-16M微量高速离心机：湘仪公司；Biometra梯度PCR仪：德国Biometra公司；凝胶成像仪：美国Bio-Rad；HS-3垂直混合器：上海一恒科学仪器有限公司；WD-9405B型水平摇床：北京市六一仪器厂；立式高压灭菌锅：博迅实业有限公司；旋涡混合仪：沪西分析仪器厂；微量进样器：上海高鸽工贸有限公司；移液器：上海万岛仪器科技有限公司微波炉：Galanz公司；低温冰箱：海尔集团；冰柜：海尔集团。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

采用酚-氯仿抽提法，抽提巴什拜羊血液中基因组DNA，溶于配好的T10E1溶液中，-20℃保存备用。

1.2.2 引物的设计与合成

参考 Genbank数据库所公布的绵羊 A-FABP基因序列 （NC_019466.2）、PBDC1基因序列（NC_019484.2），利用Premier5.0软件设计引物，引物序列见表1。由上海生物工程有限公司进行引物合成。

表1 引物序列信息

1.2.3 PCR扩增体系与反应条件

PCR 反应体系 20 μL：PCR MasterMix10 μL，DNA 模板（100 ng/uL）1 μL，上、下游引物（10 pmol/uL）各 0.5 μL，加 ddH2O 至 20 μL。反应条件：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，退火 30 s（退火温度见表 1），72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸5 min，4℃保存，产物用1.5%琼脂糖凝胶进行检测。

1.2.4 PCR-SSCP检测

参考周延清[12]等的方法对PCR产物进行SSCP分析，并判定各种基因型。

1.2.5 DNA测序

选取不同基因型的PCR扩增产物进行测序。测序结果运用Chromas软件和DNAMAN软件进行分析

1.2.6 体尺指标测定

参照《羊生产学》的方法[13]，对试验羊的体长、体高、体重、管围及胸围进行实地测量，并记录测量数据。

1.2.7 数据统计与分析

运用软件PIC-CALC与POPGENE32计算巴什拜羊A-FABP、PBDC1基因的基因型频率、等位基因频率、有效等位基因数(Ne)、多态信息含量(PIC)、杂合度(He)和纯合度(Ho)。运用Microsoft Excel 2003对巴什拜羊体重、体高、管围、体长等数据进行整理分析；运用SPSS 21.0软件中的方差分析对个体基因型与巴什拜羊的体尺数据进行显著性检验，以“最小二乘均值士标准误”表示。

2 试验结果与分析

2.1 基因组DNA检测

1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA样品，结果如图1所示，基因组DNA条带清晰，酶标仪检测结果显示DNA OD260/OD280值在1.6～1.8，表明基因组DNA的纯度比较好，可用于续试验。

2.2 巴什拜羊A-FABP、PBDC1基因的PCR检测

1.5%的琼脂糖凝胶检测A-FABP、PBDC1基因的PCR扩增产物，结果如图2、3、4所示，PCR扩增得到清晰明亮的单一条带，且扩增片段分别为157 bp、117 bp、234 bp与预期结果一致，符合SSCP试验要求。

图1 巴什拜羊基因组DNA检测结果

图2 A-FABP基因外显子2 PCR检测结果

图3 A-FABP基因外显子3 PCR检测结果

图4 PBDC1基因外显子1 PCR检测结果

2.3 SSCP检测结果

对A-FABP和PBDC1基因各引物的PCR扩增产物进行SSCP检测。在A-FABP基因的外显子2扩增片段上存在2种基因型，分别定义为GG型和GA型（图5），而在外显子3扩增片段上未检测到多态性存在（图6）；在PBDC1基因的外显子2扩增片段上存在2种基因型，分别定义为AA型和AB型（图7）。

图5 A-FABP基因外显子2分型图

图6 A-FABP基因外显子3分型图

图7 PBDC1基因外显子1分型图

2.4 测序结果分析

选择A-FABP和PBDC1基因扩增的不同类型的PCR产物进行测序，A-FABP测序结果与Genbank上发表的绵羊A-FABP基因序列（NC_019466.2）进行多序列比较，结果显示A-FABP基因存在一处突变，在3159bp处存在G→A的突变。结果如图8、9所示。氨基酸序列分析发现，A-FABP基因在3159bp处存在G→A突变并未使氨基酸发生改变，此位点的突变为同义突变；PBDC1测序结果与Genbank上发表的绵羊PBDC1基因序列 （NC_019484.2）进行多序列分析比较，发现PBDC1基因存在一处突变，在170bp处发生A碱基缺失，结果如图10、11所示。氨基酸序列分析发现，PBDC1基因在170bp处发生A碱基缺失，使苏氨酸产生移码突变。

图8 A-FABP基因的测序结果

图9 基因型测序峰图

图10 PBDC1基因的测序结果

图11基因型测序峰图

2.5 基因群体遗传结构分析

2.5.1 A-FABP基因群体遗传结构分析

2.5.1.1 A-FABP基因的基因频率和基因型频率 由表2可知，在检测的巴什拜羊群体中，A-FABP基因存在GG型和GA型2种基因型，基因型频率为0.700和0.300。G、A基因频率为0.850和0.150。G为优势等位基因。经卡方检验，A-FABP基因在巴什拜羊群体中处于哈代温伯格平衡(P＞0.05)。

表2 A-FABP基因的基因型频率和等位基因频率

2.5.1.2 A-FABP基因的遗传参数值 由表3可知，A-FABP基因在巴什拜羊群体中的基因纯合度是0.745，基因杂合度是0.255，有效等位基因数是1.342，多态信息含量为0.222，为低度多态位点。

表3 A-FABP基因的基因纯合度、杂合度、有效等位基因和多态信息含量

2.5.1.3巴什拜羊A-FABP基因不同基因型与生长性状的关联分析 由表4可知，在巴什拜羊群体中，GA型个体的胸围、体重和体长均显著高于GG型个体（P＜0.05），GA型个体和GG型个体的体高和管围等指标差异不显著（P＞0.05）。因此，初步推测A-FABP基因在3159bp处的突变有可能作为一种遗传标记，通过对优势基因型的选择，加快对巴什拜羊育种的遗传改良。

表4 A-FABP基因不同基因型与巴什拜羊生长性状的关系（平均数±标准误）

2.5.2 PBDC1基因群体遗传结构分析

2.5.2.1 PBDC1基因的基因频率和基因型频率 由表5可知，在检测的巴什拜羊群体中，PBDC1基因存在AA型和AB型2种基因型，基因型频率为0.717和0.283。A、B基因频率为0.858和0.142。A为优势等位基因。经卡方检验，PBDC1基因在巴什拜羊群体中处于哈代温伯格平衡(P＞0.05)。

表5 PBDC1基因的基因型频率和等位基因频率

2.5.2.2 PBDC1基因的遗传参数值 由表6可知，PBDC1基因在巴什拜羊群体中的基因纯合度是0.757，基因杂合度是0.243，有效等位基因数是1.321，多态信息含量为0.214，为低度多态位点。

表6 PBDC1基因的基因纯合度、杂合度、有效等位基因和多态信息含量

2.5.2.3 巴什拜羊PBDC1基因不同基因型与生长性状的关联分析 由表7可知，在巴什拜羊群体中，AB型个体的体重、体长均显著高于AA型个体（P＜0.05），AB型个体和AA型个体的胸围、体高和管围等指标差异均不显著（P＞0.05）。因此，初步推测PBDC1基因在170bp处表现的多态有可能作为一种遗传标记。

表7 PBDC1基因不同基因型与巴什拜羊生长性状的关系（平均数±标准误）

3 讨 论

3.1 A-FABP、PBDC1基因群体遗传特征分析

纯合度、杂合度、多态信息含量、有效等位基因数等指标可以从不同方向不同角度反映群体的遗传变异的程度。群体的杂合度与遗传多样性密切相关，当群体的遗传变异较大时群体杂合度越高，说明遗传多样性比较丰富，选择潜力就越大。在本试验中，A-FABP和PBDC1基因在巴什拜羊群体中的基因纯合度分别0.745和0.757，基因杂合度分别为0.255和0.243，多态信息含量为0.222和0.214，且均为低度多态位点。表明A-FABP和PBDC1基因所发生的突变在巴什拜羊群体中遗传变异较小。

3.2 A-FABP、PBDC1基因多态性与生长性状的相关分析

近几年，有较多的研究报道关于A-FABP基因多态性，Yan等[14]对新西兰8个绵羊品种的A-FABP基因进行研究，发现8处变异位点。Xu等[15]研究发现中国3个地方品种绵羊A-FABP基因在内含子1区域内存在A到G的突变Smith等[16]研究发现澳州美利奴羊A-FABP基因变异与羊毛性状质量有关。王卓等[6]对秦川牛A-FABP基因进行研究发现第1内含子的突变位点与大理石花纹、嫩度、背膘厚等存在相关性，第4外显子的GG基因型个体的嫩度、大理石花纹、背膘厚等指标均显著高于CC基因型个体。Cho等[17]研究发现A-FABP基因外显子2的突变与牛的背部脂肪厚度有相关性。刘艳妍[18]等对秦川牛的A-FABP基因的多态性及其与肉用性状的研究发现A-FABP基因5'侧翼区的突变对肉牛的产肉性状影响较大，外显子2的SNPs与屠宰率、嫩度、胴体长和眼肌面积有相关性，外显子3的SNPs与眼肌面积有相关性，A-FABP基因的3'侧翼区突变与牛胴体深有相关性。本研究以巴什拜羊为研究对象，对AFABP基因的外显子2和外显子3区域进行研究，结果发现在A-FABP基因的第3外显子区域内未检测到突变，而在A-FABP基因的第2外显子区域内检测到多态性，存在2种基因型，分别定义为GG型和GA型，基因型频率分别是0.700和0.300。测序结果显示A-FABP基因在3159bp处存在G到A的突变，且该突变为同义突变。大量研究反应出，同义突变可以通过改变蛋白质的结构等方式影响基因的表达、改变基因的翻译效率、改变mRNA稳定性和定位，最终引起表型数据存在差异[19-21]。周明亮等[22]研究显示，IGF-I外显子3区域内A→G并未引起氨基酸改变，但该SNP位点与绵羊断奶日增重和绵羊出生后的断奶体重存在显著相关。本试验结果也表明GA型个体的胸围、体重、体长均显著高于GG型个体（P＜0.05），初步推测A-FABP基因外显子2的3159bp处存在的多态通过对优势基因型的选择，有可能作为一种遗传标记，可加快对巴什拜羊育种的遗传改良。

PBDC1是作为一种新发现的蛋白质，目前关于PBDC1的研究相对较少，且关于PBDC1基因多态性的研究还未见报道。本研究以巴什拜羊为研究对象，对PBDC1基因的多态性进行初步探索，结果发现PBDC1基因在第1外显子的170bp处发生A碱基缺失，存在2种基因型：AA型和AB型，基因型频率分别是是0.717和0.283。且AB型个体的体重和体长均显著高于AA型个体（P＜0.05），AB型个体与AA型个体的管围、体高和胸围等指标差异不显著（P＞0.05）。因此，可以初步推测PBDC1基因外显子1的170bp处表现的多态性，可作为影响巴什拜羊生长性状的一种遗传标记。

4 结论

本研究采用PCR-SSCP和DNA测序技术对巴什拜羊A-FABP、PBDC1等基因进行遗传多态性检测，并与巴什拜羊的生长性状进行相关性分析，探寻可用于巴什拜羊早期选育的分子遗传标记，结论如下：（1）A-FABP基因外显子2有多态性，存在2种基因型：GG和GA，测序结果显示在A-FABP基因外显子2的3159bp处存在G到A的突变，且该突变为同义突变。巴什拜羊的不同基因型之间体长、体重、胸围等指标差异显著。巴什拜羊A-FABP基因外显子2的3159bp处表现的多态有可能作为一种遗传标记。巴什拜羊A-FABP基因外显子3经多态性检测未检测到多态性。（2）PBDC1基因在第1外显子的170bp处发生A碱基缺失，存在2种基因型：AA型和AB型，且AB型个体的体重和体长均显著高于AA型个体（P＜0.05），因此，可以初步推测PBDC1基因外显子1的170bp处表现的多态性，可作为影响巴什拜羊生长性状的一种遗传标记。