混菌发酵对女贞子营养成分及生物活性物质含量变化的影响

聂芙蓉,张晨曦, 江青东,刘太宇,邓红雨

(1.河南牧业经济学院 动物科技学院，河南 郑州 450046；2. 河南省非常规饲料资源创新利用重点实验室，河南 郑州 450046)

女贞子为木犀科植物女贞的成熟果实，其性味甘、苦、凉，具有滋补肝肾、明目乌发的作用，其含有丰富的粗蛋白、氨基酸和矿物质等营养成分，具有极高的营养价值[1,4]。女贞子现在主要作为城市绿化树种，其产量高，且多数地区的女贞子都未被采收利用，导致大部分资源浪费，若加以利用，可产生良好的经济和社会效益。

中草药在动物生产方面的应用与开发已成为当今人们研究的一大热点，中草药在人们追求“安全、绿色、无残留”的观念中具有不可低估的份量[2]。但中草药药效慢，有的效果不太理想，剂量往往偏大，一般都在1%-2%，这主要与中草药有效成分含量不高，植物细胞壁阻碍有效成分的渗出、吸收有很大关系[3]。随着生物技术的发展，利用微生物发酵中草药来提高药效，取代抗生素，在畜牧、水产养殖等方面变得越来越重要，已成为当今研究的热点。

利用不同微生物对女贞子发酵的研究尚未见报道。本试验利用酵母菌、枯草芽孢杆菌对女贞子进行发酵，测定女贞子被发酵前后营养成分和生物活性成分含量的变化，为女贞子在畜牧生产中的应用，开发新的饲料添加剂提供依据。

1 试验材料

菌种：酵母菌、枯草芽孢杆菌，均由河南牧业经济学院食品与生物工程学院微生物实验室提供。

女贞子：购于郑州隆泰大药房。

2 试验方法

2.1 女贞子发酵前的预处理

将女贞子置于65℃烘箱内烘干，粉碎后过60目筛，121℃高压蒸汽灭菌30min，备用。

2.2 培养基的配制

2.2.1 LB培养基的制备

本试验采用LB固体培养基和LB液体培养基。500mL的LB液体培养基，需向500mL去离子水中加入1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母粉、1%的氯化钠，加热搅拌直至溶质全部溶解后调pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌15 min，备用。配制500mL的LB固体培养基，在LB液体培养基的基础上加入1.5%-2%的琼脂粉即可，加热搅拌直至溶质全部溶解，调pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌15min，倒平板，置入超净台上备用。

2.2.2 PDA固体培养基的制备

配制500mL的PDA固体培养基，在500mL去离子水中加入18.5gPDA粉末，加热搅拌直至溶质全部溶解后调pH至7.0，然后121℃高压蒸汽灭菌15min，倒平板，置入超净工作台上备用。

2.2.3 YPD液体培养基的配制

配制500mL的YPD液体培养基，需向500mL去离子水中加入1%的蛋白胨、0.5%的酵母粉、2%的氯化钠,搅拌直至溶质全部溶解后，用氢氧化钠调pH至7.0，然后121℃高压蒸汽灭菌15min，备用。

2.3 菌种的纯化及菌悬液制备

2.3.1 酵母菌的纯化及菌悬液制备

酵母菌纯化：在超净工作台上，用接种环挑取单个菌落于PDA固体培养基上平板划线后，放入30℃的电热恒温培养箱中培养24h后取出，镜检。

酵母菌菌悬液制备：在超净工作台上，用接种环挑取单个菌落于YPD液体培养基，摇匀，于30℃恒温振荡培养箱中培养24h，镜检，计活菌数，为108个/mL，放入4℃冰箱，备用。

2.3.2 枯草芽孢杆菌的纯化及菌悬液制备

枯草芽孢杆菌的纯化：在超净工作台上，用接种环挑取单个菌落于LB固体培养基上平板划线后，放入30℃的电热恒温培养箱中培养24h后取出，镜检。

枯草芽孢杆菌菌悬液制备：在超净工作台上，用接种环挑取单个菌落于LB液体培养基，摇匀，于30℃恒温振荡培养箱中培养24h，镜检，计活菌数，为108个/mL，放入4℃冰箱，备用。

2.4 接种发酵

试验分为四组，分别记为对照组、试验组1、2、3，每组三个重复

对照组: 分别准确称取粉碎灭菌后的女贞子粉50g于5个500mL的三角瓶中，添加无菌水混合均匀。

试验1组：分别称取粉碎灭菌后的女贞子粉末50g于5个500mL的三角瓶中，酵母菌接菌量为10%(约15mL)，添加无菌水混合均匀。

试验2组：分别称取粉碎灭菌后的女贞子粉末50g于5个500mL的三角瓶中，枯草芽孢杆菌接菌量为10%(约15mL)，添加无菌水混合均匀。

试验3组：分别称取粉碎灭菌后的女贞子粉末50g于5个500mL的三角瓶中，酵母菌接菌量为5%(约7.5mL)，枯草芽孢杆菌接菌量为5%(约7.5mL)，添加无菌水混合均匀。

上述操作均在超净工作台上进行，避免被污染，并尽快完成。将接种后的女贞子置于30℃恒温培养箱中发酵8d。

2.5 女贞子营养成分及活性物质含量的测定

营养成分含量测定：粗蛋白的测定用凯氏定氮法，粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的测定用滤袋法。

活性物质含量测定：齐墩果酸、熊果酸、女贞苷、特女贞苷采用高效液相色谱法测定；多糖类和黄酮类采用紫外分光光度法测定，以上均在河南中医药大学龙子湖校区BM612中药理化检测实验室进行检测。

2.6 数据统计分析

试验数据用Excel 2010软件作图，并用 SPSS 23.0 统计软件进行数据处理，数据使用平均值±标准差表示。

3 结果与分析

3.1 不同菌种发酵处理对女贞子营养成分含量的影响

表1 不同菌种发酵对女贞子营养成分含量的影响(n=5) mg/g

注：同行数据肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，肩标大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，肩标相同或不标注者表示差异不显著(P>0.05)，下表同

由表1可以看出， 试验1、2、3三组的CP均高于对照组， 且试验3组CP含量均显著(P<0.01)高于对照组及试验1、2组，比对照组升高了19.86%；试验1、2组与对照组相比CP略有升高，但差异不显著(P>0.05)，试验1、2组之间CP含量基本接近。

试验1、2、3三组中CF、NDF、ADF较对照组均有所降低。试验1、2组间CF差异不显著(P>0.05)，但与对照组差异极显著(P<0.01)； 试验1、2组间NDF差异显著(P<0.05)，且与对照组差异极显著(P<0.01)，试验1、2组间的ADF差异不显著(P>0.05)，但与对照组差异显著(P<0.05)；试验3组的CF、NDF、ADF下降最为明显，较对照组分别下降20.38%、13.58%、14.67%，且与对照组、试验1、2三组差异极显著(P<0.01)。

3.2 不同菌种发酵处理对女贞子生物活性物质含量的影响

3.2.1 不同菌种发酵处理对女贞子中裂环环烯醚萜类和三萜类含量的影响

表2 不同菌种发酵对女贞子中裂环环烯醚萜类、三萜类含量的影响(n=5) mg/g

由表2可以看出，试验1组女贞苷含量显著(P<0.01)高于对照组、试验2、3组，且比对照组升高21.71%，试验1、2组及对照组三组间女贞苷含量无显著差异(P>0.05)；试验1、2、3组女贞苷含量均显著(P<0.01)高于对照组，但试验1组与2、3组间均差异显著(P<0.05)，试验2、3组间差异不显著(P>0.05)。

齐墩果酸含量在三个试验组中均比对照组显著(P<0.01)升高，分别比对照组升高50.97%、80.16%、76.67%，但试验1组与2、3组差异极显著(P<0.01)，试验2、3组之间差异不显著(P>0.05)；熊果酸含量在试验1、2、3组分别比对照组升高35.46%、51.24%、51.42%，且差异极显著(P<0.01), 但三个试验组间含量无显著差异(P>0.05)。

3.2.2 不同菌种发酵处理对女贞子中总多糖和总黄酮含量的影响

表3 不同菌种发酵对女贞子中总多糖、总黄酮含量的影响(n=5) mg/g

由表3可以看出，总多糖含量在试验1、3组分别比对照组显著(P<0.01)升高31.88%、40.72%，试验2组与对照组差异显著(P<0.05)，三个试验组间也存在极显著差异(P<0.01)；总黄酮含量在试验1、2、3组均极显著高于对照组(P<0.01)，且试验3组最为明显，比对照组升高43.82%，试验1、2组间差异显著(P>0.05)，但试验3组与试验1、2组均差异极显著(P<0.01)。

4 讨论

4.1 微生物发酵女贞子对其营养成分含量的影响

中药微生物转化或生物催化, 是利用微生物的生长代谢过程中所产生的酶, 经体外生物转化技术, 对药物结构加以修饰和转化, 显著提高中药有效成分的含量[5，6-8]。微生物在生长代谢中产生多种酶破坏了女贞子中的纤维素及半纤维素的结构，使其降解形成各种糖类物质，并转化为VFA、CO2等。VFA为微生物菌体蛋白的合成提供碳架，使蛋白含量增加。女贞子中的纤维存在于细胞壁中，微生物发酵女贞子，可使部分女贞子细胞壁成分降解成可溶性糖，降低女贞子中纤维的含量，从而提高女贞子中营养成分的利用率。

付敏等[9]采用枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白地霉3个菌种对菜籽饼进行固态发酵, 优化发酵条件, 并结合中试发酵检测发酵后菜籽饼营养价值和抗营养因子含量的变化, 结果显示, 发酵后菜籽饼游离氨基酸含量提高了300.00%, 小肽含量提高了385.19%。周庆民等[10]人利用淀粉芽孢杆菌发酵黄芪茎叶，结果表明，黄芪茎叶通过生物发酵后，纤维含量降低，粗蛋白含量有所增加，本试验结果与其结果相似，表明微生物发酵女贞子会使其粗蛋白含量增加，纤维降解，女贞子利用率提高。

4.2 微生物发酵女贞子对其生物活性物质含量的影响

女贞子中的生物活性物质多存在于细胞胞浆中，经不同微生物发酵处理后，微生物在生长代谢过程中产生的多种胞外酶进入培养基，引起女贞子细胞破裂，使有效成分暴露出来[11]。

经微生物发酵过的女贞子，其女贞苷含量都有所提高，但经酵母发酵后的女贞子中女贞苷含量较其他三组差异显著，表明酵母菌发酵效果最好；试验2、3两组中女贞苷与齐墩果酸含量较对照组、试验1组差异显著，表明经枯草芽孢杆菌和混合菌处理后能最大程度地提高女贞子中女贞苷和齐墩果酸利用率。

经微生物处理的试验1、2、3三组多糖类、黄酮类含量均有所升高，且经混合菌发酵后的对照组多糖、黄酮含量升高40.72%、43.82%，表明混合菌种发酵效果最好，这与刘洋等[12]人利用混合菌发酵复方中草药所得总黄酮和粗多糖分别比未发酵提高了55.14%、55.42%结果相似；杨静云等[13]人利用红曲霉菌发酵山楂、泽泻、决明子复方中草药，结果表明，发酵后熊果酸含量提高了767.6%，这与本试验中试验1、2、3三组熊果酸含量分别升高35.46%、51.24%、51.42%的结果相似。

5 结论

经微生物处理后的女贞子中粗蛋白和生物活性物质含量均有所提高，纤维含量降低，大部分以混合菌发酵效果最好，单菌次之。因此，可以用微生物发酵女贞子的方式来提高女贞子的利用率。