纤维素酶对小麦秸秆降解的响应面分析

索江华，李凤玲，任慧平，金 婷

( 河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，河南 郑州450046 )

河南常见的中低质粗饲料主要有玉米秸秆、小麦秸秆等，其特点是纤维素含量约占干物质的60%，粗蛋白质含量相对较低，消化率低，适口性差，直接饲喂这些中低质粗饲料对反刍动物来说营养价值不高[1]。对中低质粗饲料进行适当的加工处理能大幅提高其利用率，尤其是生物酶解法，反应条件温和、设备简单、能耗低，无污染，能有效提高饲料利用率。本文就纤维素酶提高对小麦秸秆的降解效率，在单因素试验的基础上，应用响应面分析法对纤维素酶降解小麦秸秆工艺条件进行优化，获得了纤维素酶降解小麦秸秆的最适条件，为有效提高纤维素酶的催化效率提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

纤维素酶，河南牧业经济学院生化物学实验室提供；小麦秸秆，采摘河南农业大学试验田，处理为干物质，粉碎过40目筛待用；葡萄糖、乙酸-乙酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，均为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；3,5-二硝基水杨酸(上海谱振生物科技有限公司)。

电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)，紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱，SHA-C水浴恒温振荡器等。

1.2 分析方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线[2]

1.2.1.1 葡萄糖标准贮备溶液(10 mg/mL)

称取(103±2)℃烘干至恒重的无水葡萄糖1 g，用水溶解并定容至100 mL。

1.2.1.2 葡萄糖标准曲线绘制

取7支洗净烘干的25 mL试管，分别加入葡萄糖标准贮备溶液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，补充蒸馏水至10 mL，再各加入1.5 mL DNS后摇匀，沸水浴5min，冷却后定容至25 mL，用分光光度计测定540 nm吸光度值。以葡萄糖量(mg)为横坐标，以吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 还原糖测定[3,4]

采用DNS法。[5]

1.2.3 单因素试验设计

1.2.3.1 底物浓度对纤维素酶催化效果的影响

分别取终浓度(g/L)为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的秸秆样品加入pH 4.8乙酸-乙酸钠的缓冲溶液1.5 mL和10.0 g/L的纤维素酶样0.5 mL于50℃的水浴锅中反应1h，每个样品三次重复，并设空白对照。按照1.2.2测定还原糖的生成量，确定纤维素酶最适的底物浓度。

1.2.3.2 pH对纤维素酶催化效果的影响

取0.8 g/L秸秆样品分别加入pH为4.0、 4.8、 5.6、 6.4、7.2的缓冲溶液1.5 mL和10.0g/L的纤维素酶样0.5 mL于50℃的水浴锅中反应1h，每个样品三次重复，并设空白对照。按照1.2.2测定还原糖的生成量。确定纤维素酶最适pH。

1.2.3.3 酶浓度对纤维素酶催化效果的影响

取0.8 g/L秸秆样品加入pH 4.8乙酸-乙酸钠缓冲溶液1.5 mL，分别加入酶浓度(g/L)为5.0、10.0、20.0、40.0、100.0的纤维素酶样0.5 mL于50℃的水浴锅中反应1h，每个样品三次重复，并设空白对照。按照1.2.2测定还原糖的生成量，确定纤维素酶的最适浓度。

1.2.3.4 温度对纤维素酶催化效果的影响

取0.8 g/L秸秆样品加入pH 4.8乙酸-乙酸钠缓冲溶液1.5 mL和10.0 g/L纤维素酶样0.5 mL分别于40、45、50、55、60℃的水浴锅中反应1h，每个样品三次重复，并设空白对照。按照1.2.2测定还原糖的生成量。确定纤维素酶最适温度。

1.2.3.5 反应时间对纤维素酶催化效果的影响

取0.8 g/L小麦秸秆样品加入pH 4.8乙酸-乙酸钠缓冲溶液1.5 mL和10.0 g/L纤维素酶样0.5 mL于50℃的水浴锅中反应，时间分别为1、6、12、18、24h，每个样品三次重复，并设空白对照。按照1.2.2测定还原糖的生成量。确定纤维素酶最适反应时间。

1.2.4 响应面法对降解条件的优化试验

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken原理，以底物浓度(A)、pH(B)、酶浓度(C)、反应温度(D)和反应时间(E)为自变量，设计五因素三水平响应面优化试验。试验设计见表1。应用Design Expert8.06软件对响应面试验数据进行回归及方差分析，确定各个因素的显著性[6，7]。

表1 响应面Box-Behnken设计试验因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 底物浓度对纤维素酶催化效果的影响

由图1可知，随着底物浓度的增大还原糖含量逐渐增加，底物浓度为0.8 g/L时还原糖含量最大，底物浓度继续增大时还原糖含量开始下降。可能是因为随着还原糖量的增加，纤维素酶的活性受到抑制。

2.1.2 pH对纤维素酶催化效果的影响

由图2可知，随着pH的增大还原糖含量逐渐增加，pH为4.8时还原糖含量最大。 pH继续增大时还原糖含量下降明显，因为过酸或过碱都会降低酶的活性。

图1 底物浓度对纤维素酶降解效果的影响

图2 pH对纤维素酶降解效果的影响

2.1.3 酶浓度对纤维素酶催化效果的影响

由图3可知，随着酶浓度的增大还原糖含量逐渐升高，浓度为20 g/L时还原糖含量最大，当酶浓度继续增大时还原糖含量开始下降。酶浓度增大，导致酶和底物的碰撞几率降低，结合底物能力下降。

2.1.4 温度对纤维素酶催化效果的影响

由图4可知，随着温度升高还原糖含量逐渐增加，温度为50℃时还原糖含量最大，温度继续升高时还原糖含量开始下降。温度对酶是双重影响，随着温度的升高，酶活力增加，但达到一定温度后酶蛋白因为温度升高而变性，酶活力开始下降。

图3 酶浓度对纤维素酶催化效果的影响

2.1.5 反应时间对纤维素酶催化效果的影响

由图5可知，随着时间的延长还原糖含量逐渐增加，8h～18h时还原糖含量上升非常缓慢，18h达到最大，以后开始缓慢下降。因为随着还原糖含量的增加，还原糖抑制了纤维素酶的活性。

图4 温度对纤维素酶催化效果的影响

图5 反应时间对纤维素酶催化效果的影响

2.2 纤维素酶对小麦秸秆降解的响应面优化试验结果

2.2.1 二次响应面回归模型的建立与分析

在单因素试验的基础上，以底物浓度、pH、酶浓度、温度和时间为因素，还原糖新生成量为响应值，应用Design Expert8.0.6设计五因素三水平试验，各因素水平与试验设计结果见表2[6]。

表2 响应面法试验设计与结果

续表2

注： 试验设计46个关键点，其中40个分析点。对以上数据进行建模

2.2.2 回归模型的建立

用Design-Expert 8.0.6软件对表2的结果进行多元回归分析，对以上46个数据建立二次响应面回归模型为：Y=-457.53302+106.11562*A+56.08620*B+0.61508*C+11.71187*D+1.22271*E+6.96875*A*B-0.12844*A*C-2.02750*A*D+1.16875*A*E-0.013203*B*C-0.76625*B*D-0.18542*B*E-0.010537*C*D-7.29167E-004*C*E-0.040583*D*E-49.62500*A2-2.22135*B2+1.75000E-004*C2-0.054667*D2+0.019653*E2，Y是预测的还原糖含量。

表3 响应曲面二次多项式模型的方差分析

注：*差异不显著(P>0.1000)；***差异显著(P<0.0500)

方差分析和显著性检验结果如表3，该模型F值=16.25，P<0.0001，表明此模型具有高度的显著性；该模型P=0.4071(P>0.1000)，差异不显著。R2=0.9286，说明响应值的变化有92.86%来源于所选变量；Radj2=0.8714，说明建立的模型能够解释87.14%响应值的变化；Adeq Precision=16.969，远大于5，可知回归方程可信度很高，试验误差较小。P值、R2、Radj2以及Adeq Precision等多项数值均显示，该模型效果理想，适用于分析和预测纤维素酶对小麦秸秆降解生成还原糖量的变化。

2.2.3 各因素交互作用优化分析

利用Design-Expert 8.0.6分析得到纤维素酶对小麦秸秆降解生成还原糖含量的相应面分析图，如图6～10所示。

图6 底物浓度 g/L(A)和pH(B)对还原糖含量的影响

图7 底物浓度(A)和温度(D)对还原糖含量的影响

图8 底物浓度(A)和时间(E)对还原糖含量的影响

图9 pH(B)和温度(D)对还原糖含量的影响

图10 酶浓度(C)和温度(D)对还原糖含量的影响

图6表示，在温度45℃、时间12h和酶浓度20g/L时，底物浓度和pH之间相互作用对还原糖含量的影响。当pH一定时，随着底物浓度的增加，还原糖含量逐渐升高，在底物添加量为0.6g/L时达到最高点。当底物浓度一定时，pH在一定范围内，也呈现相同的变化趋势。图7表示，在pH4.8、酶浓度20g/L、时间12h条件下，底物浓度和温度相互作用对还原糖含量的影响。随着底物浓度的增加，还原糖量逐渐增加，在底物浓度为0.6g/L时还原糖量达到最大值之后逐渐下降；随着温度的升高，还原糖量也逐渐增加，在温度达到50℃时，还原糖量达到最大。图8表示，在pH4.8、酶浓度20g/L、温度45℃条件下，底物浓度和时间对还原糖含量的影响。底物浓度为0.6g/L时达到最大，随着浓度升高，还原糖生成量逐渐下降。当时间在12h时还原糖量达到最大，之后逐渐下降。从等高线可知，时间在一定范围内，底物浓度对还原糖生成量影响较大。图9表示，在底物浓度0.6g/L、酶浓度20/L、时间为12h，pH和温度对还原糖含量的影响。从等高线可以看出，pH对还原糖生成量影响较大。图10表示，在pH 4.8、底物浓度0.60g/L、时间12h，随着酶浓度增加，还原糖含量在逐渐降低，随着温度升高还原糖量也在升高，从等高线可以看出，酶浓度响应面坡度角较大，其对还原糖生成量影响也较大。

3 结论

本实验就纤维素酶对小麦秸秆降解过程中各因素对降解效果的影响，各因素次序为酶浓度>底物浓度>pH>时间>温度，上述结果表明，在一定范围内，酶添加量对降解效果影响较大，与禚同友研究相吻合[8]。其次为底物浓度、pH的影响。时间对还原糖的含量也有一定的影响，导致酶降解率降低。适宜的温度有利于提高酶解效率，温度过高或过低均导致酶失活，降解率下降。本实验所得最佳降解条件为：底物浓度0.6 g/L、酶浓度20.0 g/L、酶反应温度50℃、pH 4.8、酶反应时间12 h。