养心颗粒对易损斑块Rho/Rho激酶信号通路血清IL-1、MCP-1和AngⅡ表达的影响*

刘影哲 张 爽 潘祥宾

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001）

动脉粥样硬化（AS）是一种血管的炎性疾病，同时也是冠心病及高血压等心脑血管疾病的危险因素，2017中国心血管病报告显示，中国心血管病患者呈逐年递增趋势，患病人数近3亿，病死率仍居首位［1］，而AS的病因和发病情况目前仍未确定，AS防治方面也尚未完善［2］。最新研究显示，Rho/Rho激酶通过多种途径介导了心血管疾病的发生［3］。炎症反应在AS的发生发展中占据着重要作用［4］。因此，通过调控Rho/Rho激酶信号通路抑制炎性因子传导，从而减慢AS斑块形成速度，这可能是防治AS新的有效靶点。前期研究结果表明，养心颗粒能防心纤维化，抑制心室重构，缓解心衰［5］。本实验旨在观察养心颗粒对易损斑块Rho/Rho激酶信号通路及炎症因子血清白介素-1（IL-1）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）表达的影响，探讨其抗AS的作用进而实现斑块稳定的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 32只雄性家兔，体质量（2.4±0.2）kg，均来自于黑龙江中医药大学动物实验中心，动物合格证号 SYXK：（黑）2013-012。在通风、温度 20～23 ℃、温度适宜的实验室环境里分笼喂养。

1.2 试药与仪器 1）药物：养心颗粒（组成：茯苓、炙黄芪、茯神、当归、法半夏、川芎各15 g，酸枣仁、五味子、远志、肉桂、柏子仁、人参各10 g，炙甘草12 g）。由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制备成粉末，每克粉末中含7 g生药，将中药粉末加蒸馏水定期配制成混悬液；法舒地尔 （天津红日药业股份有限公司，批号 1709081）。 2）试剂：兔 IL-1、MCP-1、AngⅡ试剂盒（美国R＆D生物技术公司）；中国斑点蝰蛇毒（Chinese Russell′s viper Venom，CRVV，广州蛇毒研究所）；组胺及p53腺病毒载体。3）仪器：2.5 mm×15 mm PTCA球囊（日本TERUMO公司）；手推式压力器（爱尔兰MERITMEDICAL公司）。

1.3 模型制备 采用2.5 mm×15 mm球囊经颈总动脉连接手推式压力器介入损伤家兔颈总动脉，并予高脂饲料喂养8周来制备粥样硬化斑块模型，8周末经体表超声多普勒检查证实颈总动脉斑块的形成，利用p53基因腺病毒注射液局部转染斑块处制备易损斑块模型，各组模型按0.15 mg/kg腹膜下注射中国斑点蝰蛇毒，0.02 mg/kg耳缘静脉注射组胺，处死前采血。模型复制成功标准：造模组可见颈总动脉内膜增厚，动脉粥样硬化斑块形成，管腔明显狭窄。

1.4 分组及给药 随机将家兔分为模型对照组、养心颗粒组和法舒地尔组，每组8只予高脂饲料喂养8周；空白对照组则选用同系家兔8只，予普通喂养。按人兔给药剂量体表面积折算公式计算给药量，养心颗粒组按0.643 g/kg给药；法舒地尔组予法舒地尔（天津红日药业股份有限公司，批号：1709081，规格 2 mL∶30 mg）5 mg/kg给药，每日1次，连续灌胃2周。其他两组均灌胃等量蒸馏水。

1.5 标本采集与检测 1）家兔耳缘静脉取血，以4000 r/min离心5 min，取上层血清，-20℃冷冻保存。按照IL-1试剂盒、MCP-1试剂盒和AngⅡ试剂盒方法测定相应指标含量。2）颈总动脉根部取一段长约0.5 cm，予甲醛固定，计算主动脉斑块面积（PA）和管腔面积（LA），取PA/LA均值进行统计学分析。

1.6 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，相关性分析采用Pearson直线相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组家兔血清IL-1、MCP-1、AngⅡ表达水平比较见表1。 与空白组比较，模型组 IL-1、MCP-1、AngⅡ水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，养心颗粒和法舒地尔组IL-1、MCP-1、AngⅡ水平明显降低（P＜0.05）；与法舒地尔组比较，养心颗粒组IL-1、MCP-1、AngⅡ水平变化，差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组家兔 IL-1、MCP-1、AngⅡ表达水平比较（ng/L，±s）

表1 各组家兔 IL-1、MCP-1、AngⅡ表达水平比较（ng/L，±s）

与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。 下同

组 别 n A n gⅡI L-1 M C P-1空白组 8 2 2 0.0 1±1 7.8 6模型组 8 2 4 3.8 6±2 4.1 2*养心颗粒组 8 1 9 7.3 6±2 0.4 5△5 2.3 1±1 2.0 6 4 7 1.7 2±5 2.6 1 6 2.8 7±7.3 7* 5 2 1.2 7±3 2.3 7*3 8.7 9±6.4 7△ 4 2 1.3 3±5 1.4 5△法舒地尔组 8 1 8 3.1 5±9.1 7△4 0.4 1±6.9 9△ 3 9 0.7 5±4 9.9 6△

2.2 各组家兔颈总动脉管腔狭窄程度的比较 见图1，表2。与空白对照组比较，模型组家兔颈总动脉PA/LA比值升高（P＜0.05）；与模型组比较，养心颗粒组和法舒地尔组家兔颈总动脉PA/LA比值降低 （P＜0.05）；养心颗粒组和法舒地尔组比较，PA/LA比值差异无统计学意义（P>0.05）。

图1 各组家兔颈总动脉根部PA/LA比值比较

表2 各组家兔颈总动脉根部PA/LA比值比较（%）

2.3 各组家兔血清IL-1、MCP-1、AngⅡ表达水平相关系数比较 见表3。IL-1、MCP-1、AngⅡ表达水平两两呈正相关（P＜0.05），其中MCP-1与AngⅡ的相关性最强。

3 讨 论

动脉粥样硬化易损斑块是防治不良心血管事件的重点，异常的切应力可使血管通透性升高促使斑块生长和炎症反应的发生［6］，加速斑块破裂和新生血管的生成［7］，易损斑块一旦发生破裂形成动脉血栓，会诱发不稳定型心绞痛、急性心肌梗死等严重并发症出现。中医根据AS的临床表现将其概括为“中风”“胸痹”等疾病范畴。中医学认为，本虚标实为AS的病机，其“标实”表现为气滞、寒凝、痰浊、血瘀，“本虚”为肾虚、气虚，而笔者认为冠心病的病机概括为心气不足，其心神失养贯通整个疾病的过程。故临床以益气养血、养心安神为治疗大法的养心颗粒医治本病。养心颗粒是由古方养心汤的药物组成而研制成颗粒粉末，由当归、炙黄芪、茯苓、五味子等十余味药组成。现代药理学研究发现，黄芪对心血管系统有改善心肌肥大、缓解心肌缺血、抗病毒和防心纤维化、扩张主动脉血管的作用［8］。五味子能营养心肌、改善睡眠、抗心律失常［9］。

表3 各组家兔血清IL-1、MCP-1、AngⅡ表达水平相关系数比较（ng/L，±s）

表3 各组家兔血清IL-1、MCP-1、AngⅡ表达水平相关系数比较（ng/L，±s）

指标 A n gⅡI L-1 M C P-1 I L-1（n g/L） 0.4 9 3 M C P-1（n g/L） 0.7 4 7 0.5 4 9 0.5 4 9 ——A n gⅡ（n g/L） —0.4 9 3 0.7 4 7

研究发现，在AS斑块中可发现有激活状态的Rho激酶，Rho激酶被激活后参与调控相关炎症因子，促进AS斑块形成，表明Rho激酶信号通路的激活与AS疾病的演变过程紧密相连［10］。本实验中也发现模型组颈总动脉组织中有处于激活状态的Rho表达。Rho是一种能产生多种生物学效应的活性G蛋白，其本质为具有 GTP 酶活性的鸟苷三磷酸（GTP）结合蛋白［11］。 Rho在鸟苷二磷酸结合失活形式与GTP结合活化形式间进行转换，调控下游效应物质的激活与失活［12］，参与多种细胞功能，包括收缩、迁移、黏附、增殖、凋亡等［13］。在AS形成过程中，Rho激酶能上调促炎症反应和促血栓形成因子， 如 IL-1、IL-6、MCP-1、TNF-α、AngⅡ等细胞因子，可通过多种途径调节细胞信号转导系统，共同参与AS等心脑血管疾病的调节过程。本研究结果亦表明，IL-1、MCP-1与AngⅡ表达水平具有良好的相关性。RhoA/ROCK激活后可调节胞质内核转录因子转移，调节下游IL-1β等炎性反应因子的生成［14］。实验研究表明［15］，在高脂喂养下的ApoE基因小鼠体内发现炎症因子IL-1β和α干扰素表达明显增高，表明该种模型小鼠更容易形成易损斑块，动脉粥样硬化模型小鼠血清IL-1β表达水平越高，主动脉内膜增厚、脂质斑块弥漫越显著。Rho激酶可促进MCP-1的表达介导内皮细胞的激活，而趋化因子MCP-1又能促进巨噬细胞聚集、渗透，诱导巨噬细胞吞噬oxGLDL导致脂质沉积，分泌促炎细胞因子，致使基质金属蛋白酶释放，同时对外周血中的单核细胞有特异性的趋化作用，使其迁移至内皮下活化成巨噬细胞，形成泡沫细胞参与炎性反应和 AS 的斑块形成［16］。 研究发现［17］，血浆中 MCP-1浓度与PI呈正相关性，两者在AS基础上可发生炎症、凝血甚至血栓，它引起的炎症反应可使 AS斑块破裂，而且MCP-1含量越高，AS不稳定性增加，斑块破裂的风险更有可能发生。AngⅡ生物活性较强，可分泌多种生长因子和炎性细胞，引起氧化应激造成内皮损伤或炎症状态。De Silva等研究发现，异常的ROCKⅡ信号激活后可造成AngⅡ介导的内皮细胞损伤而产生炎性反应，导致心脑血管疾病的发生［18］。徐敏等发现将高脂饮食的ApoE基因缺陷大鼠通过皮下植入方式填充AngⅡ，结果发现实验组术后更易形成易损斑块［19］。本研究在实验过程中发现模型组炎性细胞因子IL-1、MCP-1及AngⅡ表达水平明显升高，提示炎症反应存在。

本研究结果表明，炎性细胞因子之间存在紧密的联系，共同参与了AS的演变过程，而服用养心颗粒治疗后，发现Rho/Rho激酶信号通路被明显阻断，炎性细胞因子IL-1、MCP-1及AngⅡ表达水平明显降低，颈总动脉内膜的斑块面积明显减小。笔者认为养心颗粒可能通过调控Rho/Rho激酶信号通路水平，抑制AS病理变化过程中炎性因子的表达，降低炎症反应，发挥抗AS的作用进而实现稳定易损斑块的作用机制。但对于养心颗粒是否通过干预其他相关信号通路来发挥抗AS的作用，有待进一步深入研究。