恩替卡韦抗病毒患者乙型肝炎病毒逆转录区准种动态演变及其临床意义分析

刘斐 刘寿荣 傅晓晴 郭晓凤 刘春涛 武瑞 李春青

[摘要] 目的 探討恩替卡韦（ETV）初治应答不佳的慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者体内乙型肝炎病毒逆转录区（HBV RT）准种动态变化规律及其临床意义。 方法 收集5例2014年11月～2017年12月期间在我院住院及门诊应用ETV初始治疗（0.5 mg/d）应答不佳的患者资料，留取各患者治疗过程中基线、4周、12周、24周、36周和48周血清标本冻存于-70℃备用，并检查生化指标、血清学指标、HBV DNA水平等。提取HBV DNA，PCR法扩增HBV RT区，HBV-DNA≥1E+04 IU/mL的模板直接扩增，HBV DNA<1E+04 IU/mL的模板，应用巢式PCR扩增。回收目的片段并进行T-A克隆，每个标本挑取20～30个克隆，取鉴定为阳性的克隆测序，采用ClustalX 1.81软件和NCBI BLAST工具，将HBV序列进行比对，分析其氨基酸替换形式及准种分布情况。 结果 本实验5例ETV应答不佳患者治疗过程中共检出7种病毒株变异形式，分别是 rtM204I、rtM204IV、rtT184L、rtM204V+rtL180、rtM204I+rtL180M、rtM204I+rtL180M+rtT184L、rtM204V+rtL180M+rtT184L。各种病毒株所占比例在不断发生变化，抗病毒之前野生株是绝对优势株，出现病毒学突破时，耐药突变株成为种群中优势株。 结论 在ETV抗病毒药物压力下，CHB患者HBV RT区准种分布处于动态变化中，准种变化与ETV抗病毒药物敏感性以及耐药性密切相关。rtM204I/V+rtL180M+rtT184L是与ETV耐药相关的主要变异模式。

[关键词] 恩替卡韦；抗病毒；乙型肝炎病毒；准种

[中图分类号] R512.62 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）27-0016-06

[Abstract] Objective To investigate the dynamic changes and their clinical significance of HBV RT quasispecies in chronic hepatitis B（CHB） patients with poorly initial response to Entecavir（ETV）. Methods The data of patients with poor response to initial treatment（0.5 mg/day） of ETV in the Outpatient and Inpatient Department of Hangzhou Xixi Hospital （Hangzhou Sixth People's Hospital） from November 2014 to December 2017 were collected. The serum samples at baseline， 4 weeks， 12 weeks， 24 weeks， 36 weeks， and 48 weeks were taken from each patient during treatment for cryopreservation at-70°C for further use. The biochemical indicators， serological indicators， HBV DNA levels and other indices were examined. The HBV DNA was extracted， and PCR was used for the amplification of HBV RT region. The template of HBV-DNA≥1E+04 IU/mL was amplified directly. The template of HBV DNA <1E+04 IU/ml was amplified by nested PCR. The target fragment was recovered and T-A cloning was performed. 20-30 clones were selected per specimen， and the clones identified as positive were sequenced. The HBV sequences were compared using ClustalX 1.81 software and NCBI BLAST tools. The amino acid substitution form and distribution of quasispecies were analyzed. Results In this study， 7 variants of the virus strains were detected during the course of treatment in 5 ETV poorly responding patients. They were rtM204I， rtM204IV， rtT184L， rtM204V+rtL180M， rtM204I+rtL180M， rtM204I+rtL180M+rtT184L， rtM204V+rtL180M+rtT184L， respectively. The proportion of various strains was constantly changing. Wild strains are absolute dominant strains before antivirus. In the event of a virological breakthrough， resistant mutants became the dominant strains in the population. Conclusion Under the pressure of ETV antiviral drugs， the quasispecies distribution of HBV RT region in CHB patients is in a dynamic change. Quasispecies changes are closely related to the sensitivity and drug resistance of ETV antiviral drugs. rtM204I/V+rtL180M+rtT184L is the main variant pattern associated with ETV resistance.

[Key words] Entecavir； Antiviral； Hepatitis B virus； Quasispecies

恩替卡韦（Entecavir， ETV）是环戊烯类抗病毒药物，对HBV有较强的抑制能力，且有较高的耐药屏障，被EASL和AASLD作为慢性乙型肝炎抗病毒治疗一线推荐药物之一。但随着抗病毒治疗时间的延长和治疗群体的不断扩大，临床上ETV治疗应答不佳或无应答的患者在逐渐增加。2005年我国的《慢性乙型肝炎防治指南》明确提出准种概念[1]，是指HBV感染患者体内形成的以优势株为主的相关突变株病毒群。准种概念强调的是遗传学上高度相关而又有微小不同，同时在自身免疫和外界因素的作用下群体的构成又处于不断的变化中，研究准种群的动态变化，对于研究抗病毒药物敏感性以及耐药发生有关键性作用[2]。本课题应用PCR-克隆-测序法对5例ETV抗病毒治疗应答不佳患者的HBV RT区的氨基酸替换形式及准种分布情况进行48周动态分析，以探讨HBV准种群体在临床常用的抗病毒药物ETV治疗过程中的动态变化规律及其临床意义，为相关耐药的早期发现提供更充分的理论依据。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 入组标准 选取5例2014年11月～2017年12月期间在我院住院及门诊就诊且符合《慢性乙肝防治指南》CHB诊断标准的CHB患者，所有患者初始并规范服用ETV（0.5 mg/d）抗病毒治疗。

1.1.2 应答不佳的界定 抗病毒治疗12周，HBV-DNA仍然>1E+3 IU/mL为应答不佳；病毒学突破指乙肝患者接受核苷类似物治疗时，在治疗过程中HBV-DNA水平比最低值升高超过1 log10 IU/mL。

1.2 方法

1.2.1 HBV-DNA的提取及扩增 用QIAamp blood mini Kit提取5例CHB患者各观察点的HBV-DNA。应用聚合酶链式反应（PCR）扩增HBV RT区，对HBV-DNA≥1E+04 IU/mL的模板用PCR直接扩增，反应体系设20 μL，根据文献设计并合成HBV外侧引物：正向5'-CCTCACCCATATCGTCAA-3'和反向3'-GAGCCACAAAGGTTCCAC-5'；内侧引物：正向5'-GACTCG-TGGTGGACTTCTCTCA-3'和反向3'-GCAAACCCCA-AAAGACCCAC-5'。反应条件：94℃ 3 min，94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，共循环35次。对于HBV DNA<1E+04 IU/mL的模板，应用巢式PCR进行扩增。取第一轮的PCR产物1 μL为模板，反应体系同样设为20 μL，反应条件同第一轮PCR。

1.2.2 克隆与测序 所有PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用QIAgen胶回收试剂盒回收含有目的DNA片段。取凝胶回收DNA 2 μL，DNA maker（QDL 2000）6 μL进行电泳，应用Image Lab软件计算凝胶回收DNA的浓度值。配置10 μL反应体系，按照与PMD-19T载体0.5 μL的摩尔比为6：1加入凝胶回收产物进行T-A克隆。恒温4℃过夜后转化至感受态细胞DH5α大肠杆菌菌株。每个标本随机挑取20～30个圆形单克隆菌落，分别加入3 mL含氨苄青霉素的LB培养液中进行培养，取菌液2 μL 再次进行PCR鉴定，引物为：正向5'-GACTCGTGGTGGACTTCTCTCA-3'和反向3'-GCAAACCCCAAAAGACCCAC-5'。反应体系设为20 μL，反应条件：94℃ 3 min，94℃30 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，循环35次。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，取鉴定为阳性的克隆菌液810 μL测序。序列峰图用ClustalX 1.81软件分析，序列采用NCBI BLAST工具进行比对。

2 结果

2.1 5例患者的一般情况

见表1。

2.2患者的HBV-DNA及ALT动态变化

本实验共有5例治疗12周时HBV-DNA未降至检测下限的患者，随访至48周，有2例患者（患者1、5）在治疗48周时HBV-DNA转阴，ALT下降至正常水平。有3例（患者2、3、4）在48周时出现病毒学突破，见图1。

2.3 准种动态变化分析

对5例患者的血清标本均行PCR产物克隆测序，通过与GenBank中公布的标准病毒株序列进行比对，共检出7种病毒株变异形式，分别是rtM204V、rtM204I、rtT184L、rtM204V+rtL180M、rtM204I+rtL180M、rtM204I+rtL180M+rtT184L、rtM204V +rtL180M +rtT184L。基线时，5例患者HBV RT区优势株均为野生株。

2.3.1 治疗48周HBV-DNA转阴患者的准种演变 见表2。患者1在ETV治疗后病毒快速下降，治疗第4周降至4.5log10 IU/mL，此时检出rtM204I变异株，所占克隆比例为16%，后rtM204I变异株逐渐累积。至治疗24周时rtM204I变异株所占克隆比例达到62%，且此时病毒载量升高至5log10 IU/mL，之后继续ETV抗病毒治疗，至治疗48周HBV-DNA转阴，rtM204I变异株所占克隆比例逐渐减少至40%。患者5在治疗第12周时检出rtM204V变异株，此时病毒载量下降为3log10 IU/mL，在此之后rtM204V变异株呈现出逐渐增多的趋势，在治疗24周、36周时，rtM204V变异株所占克隆比例分别为46%、50%，48周HBV-DNA转阴时为68%，该患者在治疗12周后病毒载量出现下降缓慢，反复波动在3log10 IU/mL，直到48周rtM204V變异株比例逐渐降低，HBV-DNA才降至检测下限。此2例患者的HBV-DNA及准种的后续变化趋势，还在继续随访中。

2.3.2 出现病毒学突破患者的准种演变 患者2在ETV抗病毒治疗之初病毒载量也快速下降，在治疗第12周开始出现病毒载量下降缓慢，同时此时检测出rtM204I突变株（42%），治疗24周检测出M204I、T184L突变株，所占比例分别为43%、26%，此时患者HBV-DNA出现轻度升高，继续ETV抗病毒治疗第36周时，该患者体内检测出rtM204I+rtT184L+rtL180M联合突变株（48%），至治疗第48周时联合突变株替代野生株成为准种中的绝对优势株，占比达100%，伴随着该患者的病毒学突破及ALT上升。患者3在整个治疗过程中病毒均在下降，主要表现为病毒载量下降缓慢，到治疗36周时病毒仍未降至检测下限，分析治疗过程中其准种动态变化发现，该患者在第4周时体内已检出rtM204V突变株（11%），rtM204V+rtL180M、rtM204V+rtT184L+rtL180M联合突变株在24周被检出，占比分别为42%、15%，rtM204V+rtT184L+rtL180M在48周时成为绝对优势株，同时该患者出现病毒学突破。患者4在治疗前病毒载量较其他患者相对偏低，为5log10 IU/mL，但该患者在ETV抗病毒治疗12周时病毒载量较治疗前下降不到1log10 IU/mL，分析其准种演变发现，该患者在治疗12周时即出现了rtM204V+rtL180M联合突变株，在HBV准种中的克隆比例为8%，在治疗36周检测出rtM204V+rtL180M+rtT184L联合突变株（50%），且在HBV准种中的比例迅速累积，在治疗48周出现病毒学突破时rtM204V+rtL180M+rtT184L联合突变株所占比达91%，取代野生型毒株成为准种群体中的绝对优势株。所有患者的氨基酸替换形式及准种演变情况见表2。

3 讨论

作为目前临床一线推荐的抗病毒药物之一，ETV能够迅速抑制HBV-DNA复制，并能较好改善患者的病毒学、组织学、生化学进展，受到临床医师和患者的青睐，但是核苷（酸）类似物（NAs）也有其明显缺点，就是此类药物不能清除原始复制模板cccDNA，致使停药之后不能持久抑制病毒，目前临床抗病毒治疗越来越趋于长期用药，故临床上出现ETV治疗应答不佳、无应答甚至耐药的患者也在逐渐增加[3]。且国内外大量研究[4-5]显示拉米夫定（LAM）经治疗出现病毒学突破的患者可产生rtM204V+rtL180M耐药突变株，在此基础上仅需要再增加一个耐药位点就可进一步筛选出ETV耐药株，从而导致ETV耐药发生，治疗失败。这些都对ETV抗病毒治疗的病毒学应答提出新的挑战。

病原微生物在其自身复制过程中，由于缺乏严密的校对功能或同时在宿主免疫压力或抗微生物药物的选择压力下，其核酸成分在少数位点上容易发生突变，这种突变的逐渐累积就会形成了不同的基因型。对感染某一病原体的患者，在相对较短的时间内，核酸的突变不会构成病原体基因型改变，但会造成基因序列的差别，这种差别即构成病原体的准种现象[6-7]。由于肝细胞寿命长，cccDNA作为模板稳定的贮存在肝细胞中进行持续复制，每天可产生10个新病毒颗粒，且HBV反转录过程中RNA聚合酶缺乏3'-5'外切酶校对功能，使HBV在复制过程中容易出现碱基错配。在这种高速率复制又高错配率的情况下，造成HBV的高变异率，产生了很多变异株[8-11]，由此产生了HBV准种的概念。

免疫或抗病毒药物的选择压力下HBV准种群会发生动态演变[12-13]，其中优势病毒株决定药物敏感性。HBV准种演变符合达尔文进化论，适者生存，在接受NAs药物治疗之前的CHB患者体内HBV野生株是绝对优势株，抗病毒治疗后，对药物敏感的野生株逐渐受到抑制，含有耐药突变的变异株逐渐发展成为准种中的优势株，进而造成HBV种群整体药物敏感性转变，最终导致HBV准种群耐药[14-17]。本研究观察了5例ETV初始治疗应答不佳的CHB患者48周，用PCR-克隆-测序法分析其在治疗过程中HBV RT区的氨基酸替换形式及准种分布情况，研究结果提示，在治疗初期HBV RT区几乎全表现为野生型，在ETV抗病毒压力下，各种病毒株所占比例不断在发生变化。随着抗病毒治疗时间的延长，准种群中的各种突变株也趋于复杂，部分病毒能良好适应新的环境，并在新环境下逐渐累积，最终导致HBV-DNA出现了下降缓慢，甚至再次升高的现象，而出现病毒学突破时，耐药突变株成为种群中优势株。同时在抗病毒治疗过程中，由于HBV RT区基因突变，使得某些位点氨基酸被置换，从而导致病毒对ETV的敏感性下降，出现应答不佳甚至病毒学突破。揭示了HBV准种在恩替卡韦抗病毒压力下HBV RT区准种组成的动态变化。刘霖等[18]分析了1例拉米夫定（LAM）、ETV序贯治疗出现2次病毒学突破的患者治疗过程中准种变化，发现该患者在LAM单药治疗68周发生病毒学突破时rtL180M+M204V联合突变耐药株为优势准种（97%），再更换ETV继续抗病毒治疗后，rtLl80M+M204V突变株在治疗108、120、144周时在HBV准种群中的克隆比例分别为90%、77%和86%。治疗168周（ETV治疗72周）时，rtL180M+S202G+M204V的毒株比例升高至76%，在ETV治疗96周时，该联合突变株所占比达到88%，出现第2次病毒学突破，该研究揭示了准种在LAM、ETV序贯治疗过程中的动态演变，同时该患者两次病毒学突破均发生在原来对药物敏感的病毒株被耐药株代替时，表明了HBV准种组成与药物敏感性之间的紧密联系。秦艳丽等[19]检测了阿德福韦酯（ADV）治疗LAM耐药患者HBV RT区准种的分布情况，发现LAM耐药发生时YIDD变异株为优势株（77.8%），更换为ADV继续抗病毒治疗后，48周时在该患者体内检测出rtA181S变异株成为优势株（60%），且YIDD变异株逐渐消失，在治疗96周再次发生病毒学突破时rtA181S/V+rtN236T和A181S变异株所占比例升高至90%。该结果说明HBV准种在LAM-ADV序贯治疗过程中组成变化。Tong J等[20]觀察了2例ETV治疗出现病毒性突破的CHB患者3年，对其准种进行研究，发现在治疗48周时即已经出现L180M+rtM204 V/I变异株，野生株仍然是优势株，治疗144周出现病毒学突破时rtM204V/I+rtL180 M+S202G成为绝对优势株（79%），说明在ETV抗病毒治疗压力下HBV准种的动态变化。Wang F等[21]分析了1例先后应用LAM、ADV、ADV+替比夫定（LDT）序贯治疗的患者HBV RT区准种演变，发现YMDD变异株在治疗18周时发展成为优势株（79%），更换ADV治疗4周后YMDD变异株逐渐消失，继续治疗至68周时rtN236T耐药变异株成为优势株（59%），随后加用LDT治疗22周后rtN236T变异株消失。该结果也显示了HBV准种在核苷（酸）类似物抗病毒药物压力下HBV准种的进化过程。本研究及以上研究可以发现，患者出现病毒学突破均发生在原来对药物敏感的病毒株被耐药株代替时，表明了HBV准种组成与药物敏感性之间的紧密联系。慢乙肝的抗病毒治疗仍然是一个长期过程，准种动态演变提示我们在抗病毒治疗过程中，发现长期使用核苷类似物抗病毒治疗，但是病毒下降缓慢、甚至有反跳的患者，应对其HBV准种进行定期监测。若能够及时检测到基因型耐药，在尚未发生临床耐药前即更换抗病毒治疗方案，可降低抗病毒治疗失败的风险[22]。

同時本研究的3例ETV基因耐药患者，出现病毒学突破时的变异模式是rtM204I/V+rtT184L+rtL180M，与国内外已有的研究一致。有关恩替卡韦的耐药位点，2008年APASL会议《慢性乙型肝炎管理指南》中正式提出至少有3个位点的碱基置换才能构成有临床意义的ETV耐药，即M204V/I和L180M再加上以下任何一个ETV耐药位点T184、S202和（或）M250[23]。其中rtT184L主要存在于B、C基因型的HBV中，而我国的HBV患者以B、C基因型为主，所以rtT184L很可能是我国HBV患者rt184位点的主要变异类型。

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（收稿日期：2018-05-28）