PP242通过下调Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E信号通路与柔红霉素存在协同抗急性白血病作用

石芳芳 陈琪 杨晓净 龚玉萍 陈一瑞

[摘要] 目的 通过研究PP242单药及与柔红霉素（DNR）联合抗急性白血病的效应及作用机制，探寻急性白血病治疗的新方法。 方法 以NB4、THP-1、SUP-B15三种急性白血病细胞株为研究模型，采用MTT药物敏感试验检测PP242、DNR单药及两药联合的抗细胞增殖作用；Western Blot方法分析药物对Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E信号通路关键點蛋白磷酸化的表达水平的影响；7-甲基鸟嘌呤帽亲和分析法分析药物对eIF4F翻译起始复合物中4EBP1、eIF4E、eIF4G表达的影响；流式细胞学检测PP242的促凋亡作用。 结果 （1）MTT显示PP242、DNR单药对急性白血病细胞株均有显著的抗细胞增殖作用，而100 nmol/L的PP242与DNR联合使IC50下降明显，计算协同指数均小于1，表明两药存在协同作用。（2）Western Blot显示PP242可有效下调Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E轴的关键磷酸化蛋白及Mcl-1表达，而DNR却反馈上调这个通路的蛋白表达，PP242可协同DNR下调这条通路表达。（3）7-甲基鸟嘌呤帽亲和分析法显示PP242可增加eIF4E与4EBP1的结合，减少与eIF4G的结合，从而抑制eIF4F的形成，而DNR单药并没有这个作用。（4）流式细胞学显示PP242可促进细胞凋亡发生。 结论 PP242单药可抑制三种急性白血病细胞株的增殖，具有明显的抗急性白血病作用，分析其可能作用机制为：通过抑制Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E信号通路活性，抑制eIF4F翻译起始复合物形成以及促进细胞凋亡的发生。PP242与DNR联合有协同抗急性白血病作用。

[关键词] PP242；柔红霉素；急性白血病；协同作用；Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E轴；eIF4F翻译起始复合物；细胞凋亡

[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）27-0007-06

[Abstract] Objective To explore a new method for the treatment of acute leukemia by studying the effects and mechanisms of PP242 monotherapy and combination therapy of PP242 and daunorubicin（DNR） in acute leukemia. Methods NB4， THP-1 and SUP-B15 were used as the research model. MTT drug sensitivity test was used to detect the anti-cell proliferation of PP242， DNR and the combination of the two drugs. The Western Blot method was used to analyze the effect of drugs on expression level of key protein phosphorylation in Akt/Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E signaling pathway. 7-methylguanine cap affinity analysis method was used to analyze the effect of drugs on the expression of 4EBP1， eIF4E and eIF4G in eIF4F translation initiation complex. Cytological detection was used to detect the pro-apoptotic effect of PP242. Results （1）MTT showed that PP242 or DNR alone had significant anti-cell proliferation effects on acute leukemia cell lines， and 100 nmol/L PP242 combined with DNR decreased the IC50. The calculated synergy index was less than 1， indicating that there was synergy effect between the two drugs. （2）Western Blot showed that PP242 could effectively down-regulate the key phosphorylation protein and Mcl-1 expression of Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E axis， while DNR feedbackly up-regulated the protein expression of this pathway. PP242 could down-regulate this pathway expression in collaboration with DNR. （3）7-methyl guanine cap affinity analysis showed that PP242 could increase the binding of eIF4E to 4EBP1， reduce the binding to eIF4G， and thus inhibit the formation of eIF4F， but DNR alone didnt have this effect. （4）Flow cytology showed that PP242 could promote apoptosis. Conclusion PP242 alone can inhibit the proliferation of three acute leukemia cell lines and has obvious anti-acute leukemia effect. The possible mechanism of action is to inhibit the eIF4F translation initiation complex and promote the occurrence of apoptosis by inhibiting the activity of Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E signaling pathway. PP242 and DNR have synergistic anti-acute leukemia effects.

[Key words] PP242； Daunorubicin； Acute leukemia； Synergy； Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E axis； eIF4F translation initiation complex； Apoptosis

急性白血病是一类严重危害人类身体健康的造血干祖細胞恶性增殖性疾病。目前，急性白血病的治疗仍以化疗为主，虽然柔红霉素（DNR）为主的化疗方案其完全缓解率（CR）已高达70%～80%，但是仍有相当部分患者由于对化疗药物耐药而不能缓解，或出现复发，最终死亡。因此，寻找新的治疗药物已成必然[1，2]。

近年来研究发现Akt/mTOR信号通路与人类肿瘤的发生发展密切相关[3]，mTOR由于组成不同可分为mTORC1和mTORC2[4-6]。mTORC1通过磷酸化其下游4EBP1等调控相关蛋白的翻译[7，8]。当4EBP1被mTORC1磷酸化后，其与eIF4E的结合力减弱，释放出的eIF4E即与eIF4G、eIF4A形成翻译起始复合物eIF4F，开始蛋白质的翻译过程，被翻译的下游蛋白包括抗凋亡因子Mcl-1等与细胞增殖、凋亡有关的重要蛋白[9]。mTORC2活化后可以磷酸化Akt Ser473位点，从而活化mTORC1、4EBP1，这一反馈因mTORC1抑制剂雷帕霉素不能完全抑制4EBP1磷酸化及功能的原因[10，11]。

PP242是一种新型的小分子mTOR双靶向抑制剂，取消了mTORC2的反馈作用，表现出良好的抗肿瘤效应[12-15]。目前，有关PP242对急性白血病细胞株的抗白血病作用报道逐渐增多，但PP242与柔红霉素联合对多种急性白血病细胞株作用的报道仍不多见。

因此，接下来将研究PP242单用及联合柔红霉素对多种急性白血病细胞株的抗白血病作用，并探讨可能的作用机制。

1材料与方法

1.1细胞株和试剂

人类急性早幼粒细胞白血病细胞株（NB4），急性粒单核细胞白血病细胞株（THP-1），Ph+急性淋巴细胞白血病细胞株（SUP-B15，表达P190 BCR-ABL融合蛋白），以上细胞株均由四川大学华西医院血液科实验室提供，实验时间为2015年3月～2017年12月。SUP-B15细胞株培养于含有10%小牛血清和100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的IMDM培养基中，NB4、THP-1细胞株培养于含有10%小牛血清和100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，在37℃、5%CO2条件下培养，2～3 d 传代1次，取对数生长期细胞用于实验。PP242（sigma，美国）用DMSO溶解配制成10 mmol/L母液，冻存在-20℃，使用前用RPMI1640培养基稀释成适当的工作浓度。

1.2 MTT药物敏感实验及IC50值测定

采用MTT药物敏感实验检测细胞增殖情况。细胞株每个孔加5×104个细胞，按实验分组加入不同浓度药物，培养箱中培养72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，再置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养4 h，然后加入MTT三联溶解液100 μL，继续放在培养箱中过夜。第2天用酶标仪测定每孔在570 nm处的吸光度值，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=1-（实验孔平均OD值-空白孔OD值）/（对照孔平均OD值-空白孔OD值），绘制生长曲线。根据药物对细胞的抑制与药物浓度对数呈正比的原理，利用SPSS17.0中的Probit analys模型，计算出药物对细胞作用的半数抑制浓度（IC50）[16]。采用协同指数（CI值）来判断两种药物是否存在协同抑制细胞增殖的作用，计算公式如下：CI=D1/Dx1+D2/Dx2（D1、D2表示药物单独作用时达到某一细胞抑制作用时各自的药物浓度，Dx1、Dx2表示两种药物联合时达到相同细胞抑制作用时的药物浓度）。CI=1表示两药存在叠加作用；CI>1表示两药存在拮抗作用；CI<1表示两药存在协同作用[17]。所有实验至少重复3次。

1.3 Western blot 检测

收集经过不同药物处理24 h后的1×107个急性白血病细胞，用RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。取30～120 μg的蛋白用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，使用以下一抗：Akt，P-Akt（Ser473），mTOR，P-mTOR（Ser2448），4EBP1，P-4EBP1（Thr37/46），eIF4E，P-eIF4E（Ser209），Mcl-1，GAPDH和辣根过氧化物酶标记的二抗（Cell Signalling Technology，美国）进行免疫印迹分析。最后经ECL发光系统（Bio-Rad，美国）曝光显影，使用Quantity One软件采集图像，分析蛋白表达。

1.4 7-甲基鸟嘌呤帽亲和分析

用500 μL RIPA裂解液裂解不同药物处理24 h后的1×107个急性白血病细胞，提取总蛋白，离心所得上清液中加入50 μL 7m-GTP-Sepharose beads（GE Healthcare），置于4℃孵育1～2 h，总蛋白中的eIF4E与 beads相结合。再次离心，移去上清液，小珠子（beads）用1 mL PBS洗涤3次，50 μL上样缓冲液加入到珠子中，煮沸7 min。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，一抗4EBP1、eIF4E行免疫印迹分析[18]。

1.5 流式细胞凋亡检测

取SUP-B15、NB4、THP-1细胞，以1×106个/孔的细胞量接种至 6孔板中，分别加入PP242（实验孔）和PBS（对照孔），置37℃、5%CO2孵箱中孵育72 h。之后分别收集每个孔内的细胞，用Annexin V-FITC和propidium iodide（PI）（凯基生物公司，中国）双染法在流式细胞仪上进行细胞凋亡检测。

1.6 统计学分析

所有数据均使用SPSS17.0进行分析，以上每部分实验均重复至少三次，MTT、流式细胞学检测数据取平均值±标准差作为最后的实验数据，蛋白水平表达通过Quantity One软件进行相对定量比较。各个样本（计量资料）之间比较采用t检验或方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 PP242和柔红霉素单药对急性白血病细胞株均具有抗细胞增殖作用

NB4、THP-1、SUP-B15三种急性白血病细胞株分别培养在递增浓度的PP242和柔红霉素（DNR）中72 h，MTT结果显示PP242、柔红霉素单药对三种急性白血病细胞株的细胞抑制率分别随药物浓度增大而增加，两药最大抑制率都接近100%（图1A、C）。PP242单药作用于NB4、THP-1、SUP-B15细胞株72 h后的IC50分别为0.423 μmol/L、2.169 μmol/L、0.069 μmol/L（图1B），柔红霉素单药作用于NB4、THP-1、SUP-B15细胞株72 h后的 IC50值分别为0.007 μmol/L、0.045 μmol/L、0.004 μmol/L（图1D）。这些结果提示PP242、DNR单药均可浓度依赖地抑制三种急性白血病细胞株的增殖。

2.2 PP242可协同促进柔红霉素对三种急性白血病细胞株的抗细胞增殖作用

不同浓度的柔红霉素联合100 nmol/L的PP242分别作用于NB4、THP-1、SUP-B15三种细胞株，其细胞抑制率分别随柔红霉素浓度增大而增加，最大抑制率均接近100%（图2A），柔红霉素的IC50值分别降低到了0.004 μmol/L、0.025 μmol/L、0.002 μmol/L（图2B）。与柔红霉素单药相比，IC50值分别降低了42.9%、44.4%、50.0%。采用CI值作为判断药物相互作用的指数。以上三种细胞株中PP242与柔红霉素的CI值分别为0.81、0.60、0.34，均小于1（图2C）。这些结果提示PP242和柔红霉素在三种白血病细胞株中均存在协同抑制细胞增殖的作用。

2.3 Western Blot检测PP242与柔红霉素对急性白血病细胞株中Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E信号通路及下游Mcl-1的作用

Western Blot分析发现在NB4、THP-1、SUP-B15三种急性白血病细胞株中，柔红霉素单独应用24 h后均不同程度上调了P-Akt（Ser473）、P-mTOR（Ser2448）、P-4EBP1（Thr37/46）、P-eIF4E（Ser209）的蛋白表达，相应总蛋白水平没有变化；柔红霉素对此通路下游靶蛋白Mcl-1的表达调节作用并不确切。而PP242单药作用下，以上这些磷酸化蛋白及Mcl-1蛋白表达水平均明显下降，尤其是两者联合应用时，下调作用更加显著，在三种急性白血病細胞株中均得到相似的结果。结果显示柔红霉素可协同PP242下调Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E信号通路中相关蛋白的表达。见图3。

2.4 PP242和柔红霉素分别对三种急性白血病细胞株中eIF4F复合物的作用

通过Western Blot检测裂解细胞后的总蛋白，发现含有PP242的细胞和含有柔红霉素的细胞中4EBP1、eIF4E和eIF4G总蛋白含量没有减少。接下来检测7-甲基鸟嘌呤帽亲和分析后的蛋白，发现PP242单独作用下亲和分析后的蛋白中eIF4G含量减少，4EBP1含量增加，4EBP1与eIF4E紧密结合增加，阻止eIF4E与eIF4G结合形成eIF4F起始复合物。而柔红霉素并没有表现出与PP242同样的作用。PP242与柔红霉素两药联合后，eIF4G含量的减少以及4EBP1含量的增加程度与PP242单药作用相似甚至更加明显。结果显示PP242与柔红霉素两药联合后可以抑制eIF4F复合物的生成。见图4。

2.5 流式细胞技术检测PP242对三种急性白血病细胞株凋亡的作用

通过流式细胞学Annexin V-FITC和PI双染法检测PP242对三种急性白血病细胞凋亡的作用。2.0 μmol/L的PP242作用于THP-1、SUP-B15、NB4细胞72 h后的平均细胞凋亡率分别为38.1%、23.5%、14.3%（图5A～D）。与各自细胞株对照组（PBS）的平均细胞凋亡率进行比较，差异存在统计学意义（P均<0.05）。结果显示PP242对三种急性白血病细胞株具有促细胞凋亡发生的作用。

3讨论

PP242是一种吡唑并嘧啶类化合物，和PP30一样是小分子靶向抑制剂，由Feldman等合成，能同时抑制mTORC1和mTORC2复合物，已被证明是一种有效且选择性高的ATP竞争性mTOR抑制剂[15]。有研究发现，PP242对mTORC2的抑制作用并不能完全抑制Akt的磷酸化，但是对4EBP1的抑制作用比雷帕霉素更彻底，这也许与PP242可更强地抑制mTORC1有关；研究还提出PP242的抗细胞增殖作用是由于其可更强地抑制4EBP1的磷酸化和eIF4E活性[16]。

通过MTT实验得知PP242单药对NB4、THP-1、SUP-B15三种急性白血病细胞株具有浓度依赖的抗细胞增殖作用，柔红霉素单药亦可浓度依赖地抑制以上急性白血病细胞的增殖，且两者最大抑制率都接近100%。而柔红霉素联合PP242作用于三种细胞株时，与单药相比，具有更强的增殖抑制作用，各自的CI值均<1，说明两药的抗急性白血病作用是协同关系。

近年来的研究表明，多种血液系统恶性肿瘤尤其是白血病存在Akt/mTOR及其相关信号通路的异常激活[17-19]。mTOR下游重要蛋白4EBP1可抑制eIF4F中的主要组成因子eIF4E的功能，4EBP1在低磷酸化状态时与eIF4E紧密结合，阻止eIF4E与锚定蛋白eIF4G结合形成eIF4F起始复合物，从而不能进行mRNA翻译[20]。30%恶性肿瘤包括直肠癌、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、白血病等存在eIF4E的过度表达，从而选择性地促进帽依赖蛋白的表达，导致肿瘤的发生[21，22]。因此，课题组从以上相关信号通路方面研究了PP242单药及联合柔红霉素抗急性白血病效应可能的具体作用机制。本实验中PP242可以显著下调白血病细胞株中P-Akt（S473）的表达（mTORC2的下游底物），也下调P-mTOR（S2448）和P-4EBP1（T37/46）蛋白水平，说明PP242可同时抑制mTORC1和mTORC2。PP242也明显下调了P-eIF4E（S209）、Mcl-1蛋白的表达，与柔红霉素联用时这种下调作用更加明显。然而柔红霉素单药非但没能下调这些蛋白，反而存在普遍活化上调Akt/mTOR通路的情况。由此认为Akt/mTOR通路的反馈上调可能为柔红霉素单用的一个巨大副作用，PP242正好可以消除这个作用，也许这正是两者协同抗急性白血病的其中一个分子机制。

eIF4F即翻譯起始复合物，调控着与细胞生长、增殖、凋亡有关的许多种重要蛋白，包括抗凋亡因子Mcl-1、细胞周期调控子cyclin D1和D3、原癌蛋白c-myc等。在蛋白质翻译起始复合物组成的所有起始因子中，由于eIF4E在细胞内的水平最低（低于其他起始因子的10～30倍），它与eIF4G结合形成eIF4F起始复合物的过程成为翻译开始的限速步骤，也成为控制蛋白质翻译和表达的关键点。本研究结果显示PP242可以下调三种急性白血病细胞株的P-4EBP1、P-eIF4E水平，两者水平的下降理论上都将减少eIF4F的合成量，从而不能进行mRNA翻译。而通过7-甲基鸟嘌呤帽亲和分析确实发现PP242作用于细胞株后可减少eIF4F的合成，然而柔红霉素单药并没有这个作用。由此猜测，PP242可通过下调mRNA翻译功能，从而达到抑制肿瘤细胞生长的作用，但是柔红霉素单药却没有这个功能，不过两药联合时可相同程度甚至更加显著地下调mRNA翻译功能。这可能是PP242与柔红霉素具有协同抗急性白血病作用的另一个重要的分子机制。

Mcl-1是Bcl-2家族中的一个抗凋亡蛋白，在许多肿瘤中高表达，包括B系和T系恶性血液肿瘤[23]。Mcl-1蛋白表达通过Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E信号通路被调节，抑制mTOR的活性可以减少Mcl-1的蛋白合成；同时Mcl-1也是eIF4F下游翻译的一个蛋白[24]。Mcl-1属于抗凋亡蛋白，抑制Mcl-1的蛋白合成可以促进肿瘤细胞的凋亡。本研究结果显示，PP242可以下调白血病细胞株中Mcl-1蛋白的表达水平，且流式细胞学分析也检测到PP242可以促进三种急性白血病细胞株的细胞凋亡发生。由此提示，PP242促进急性白血病细胞凋亡的发生可能为其抗急性白血病作用的分子机制之一，Mcl-1蛋白也可成为今后抗肿瘤的一个重要靶点。

综上所述，PP242单药，尤其是PP242联合柔红霉素，对NB4、THP-1、SUP-B15三种急性白血病细胞株主要通过下调Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E信号通路活性，从而进一步抑制eIF4F翻译起始复合物形成以及促进细胞凋亡的发生而存在协同抗急性白血病的作用。PP242单独以及联合柔红霉素在治疗急性白血病领域具有广大的应用前景。

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（收稿日期：2018-05-22）