气肿疽梭菌CctA基因的真核表达

陈 竞，齐 强，罗永仁，张 皓，李成辉，任春宇，车 达，姜永越，于建华，金 鑫*

(1.延边大学农学院，吉林延吉 133000；2.珲春边境经济合作区综合服务站，吉林珲春 133315；3.延边州畜牧总站，吉林延吉 133000；4.延边州动物疫病预防控制中心，吉林延吉 133000； 5.图们市农业和畜牧业局，吉林图们 133000)

气肿疽(Gangraena emphysematosa)又被称为黑腿病或鸣疽。在自然条件下，气肿疽主要侵害牛[1]，低湿的沼泽和潮湿的山地发病率较高，故夏季高发。气肿疽梭菌(Clostridiumchauvoei)首先由Feser(1876)和Bollinger(1875)提出，Roux在1887年顺利分离出病原体。在一定条件下，气肿疽梭菌主要通过消化道、皮肤感染，患处破溃或尸体处理方法不当都会使病原菌从体外流出，形成的芽胞会污染土壤，在土壤中存活时间可长达3年。气肿疽梭菌对药物和气候条件等刺激性因素有极强的抵抗力[2-4]。气肿疽主要发病部位是肌肉最丰满的地方，按压有捻发音，患畜常伴有跛行。饮用被污染的水源和吞食饲草是导致牲畜感染的主要途径，受伤的喉咙、口腔和或者经微创的胃肠道黏膜也易于导致气肿疽梭菌侵入机体[5-6]。科研人员一直认为气肿疽梭菌不会感染人类，但新发现的病例动摇了这一看法，日本于2007年报道了有关人感染气肿疽梭菌后死亡的案例，因此，该病的发生受到了其他国家的重视并且列为重要研究对象[7]。我国在新中国成立之初，该病在中原等多处地区也曾发生过大面积流行和暴发，截止到目前，我国约20多个省市和自治区出现过该病[8]。

随着气肿疽梭菌研究的不断深入，寻找准确有效的疫苗控制气肿疽显得尤为重要。由于该病目前没有非常有效的治疗性药物，因此疫苗的研发是急待解决的问题[9]。现阶段仅有部分灭活苗在试验中取得良好的效应，但应用到实际当中的疫苗少之又少；传统的灭活苗保护性差，弱毒疫苗存在较大的安全隐患，因此核酸疫苗、蛋白质亚单位疫苗等新型疫苗的研发和推广具有广阔的前景[10-11]。在气肿疽梭菌的毒力因子中，鞭毛蛋白、唾液酸酶和细胞毒素均为较好的疫苗候选基因[12]，其中气肿疽梭菌CctA是具有重要研究价值的候选基因，因用于研制气肿疽疫苗的主要保护性抗原而被重视。本试验预测和分析了延边株气肿疽梭菌的信息，构建了气肿疽梭菌pcDNA3.1-CctA质粒并成功表达。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株及试剂 气肿疽梭菌为延边大学农学院动物医学系预防兽医学实验室分离保存；封闭群豚鼠和Balb/c小鼠，吉林省长春亿斯公司；Vero细胞，哈尔滨兽医研究所惠赠；pMD19-TSimpleVector，TaKaRa宝生物有限公司；鼠抗气肿疽梭菌CctA蛋白，延边大学农学院预防兽医学实验室制备；辣根过氧化物酶标记的Anti-mouseIgG，美国Sigma公司产品；荧光素FITC标记的Anti-mouseIgG，北京中杉金桥生物公司产品；胎牛血清和DMEM培养液，北京Gibco生物公司产品；Opti-MEM®IReducedSerumMedium，美国Gibco公司产品；限制性内切酶BamHI、XhoI、KpnI，DNA连接酶T4，DNA聚合酶ExTaq，DNA Marker DL 3 000，DNA Marker DL10 000，10×ExTaqbuffer，10×loadingbuffer，6×loadingbuffer，RNase宝生物工程(大连)有限公司产品；凝胶回收试剂盒，OMEGA生物公司产品；质粒小量提取试剂盒、抗生素Kana、Amp，Newbioindustry公司产品；Trans5α感受态cell，北京全式金生物公司产品；DAB显色液，北京中杉金桥生物公司产品；脂质体试剂盒LipofectamineTM2000，美国Invitrogen公司产品；胰酶消化液、磷酸盐缓冲液(北京索莱宝生物公司产品)；Tris、溴化乙锭等，北京生工产品；丙烯酰胺、过硫酸铵，其他试剂为国产级分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据在GenBank上发表的气肿疽梭菌CctA基因(序列号：JQ692583)，应用Primer Premier5.0软件设计了1对引物(引物由北京新产业生物公司合成)，上游5′端各带有BamHⅠ和Kozak序列，下游3′端带有XhoⅠ和TAA终止密码子，P1 5′-GGATCCGCCACCATGGGTGGGTATTATCAAGCTGATAT-3′；P2 5′-CTCGAGTTAAGTTCCTTTTGGTGCTGTAAGAG-3′。

1.2.2 基因扩增 提取鉴定后的气肿疽梭菌的DNA，并用PCR方法检测与鉴定。P1、P2，作为引物扩增CctA基因。PCR反应条件：95℃ 5 min；94℃ 45 s；48.8℃ 45 s；72℃ 1 min，共30个循环；再72℃ 10 min；4℃结束反应。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察并记录结果。

1.2.3 气肿疽梭菌CctA基因的克隆和鉴定 将经PCR扩增的目的片段CctA基因，与pMD19-TSimpleVector载体混合进行连接(16℃，2 h或4℃过夜)，将连接产物加入到Trans5α感受态细胞中混合进行转化，提取重组质粒pMD19-T-CctA，以pMD19-T-CctA作为模板用上述引物进行PCR鉴定。

1.2.4 重组质粒pcDNA3.1-CctA构建、鉴定 提取pcDNA3.1和pMD19-T-CctA，采用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收pcDNA3.1目的片段和气肿疽梭菌CctA，将双酶切后的CctA基因片段与载体pcDNA3.1片段混合(16℃，12 h)，将连接产物转化到感受态细胞中，进行培养，提取pcDNA3.1-cctA重组质粒，鉴定。

1.2.5 Vero细胞培养 将Vero细胞立即从液氮中取出，复苏，培养，传代。

1.2.6 重组质粒pcDNA3.1-CctA表达与分析 将重组质粒pcDNA3.1-CctA在长势良好的Vero细胞中进行转染，进行CctA基因的表达，并用SDS-PAGE电泳分析CctA基因的表达产物。

2 结果

2.1 CctA基因的扩增

以上述气肿疽梭菌CctA基因作为模板，P1、P2作为引物，进行PCR扩增。得到的目的片段大小与预期CctA基因片段相同，目的基因大小为519 bp(图1)。

M.DNA标准DL 3 000 ；1～4.CctA基因的PCR扩增产物；5.阴性对照(ddH2o)

M.DNA Marker DL 3 000; 1-4.PCR products of CctA gene; 5.Negative control

图1 CctA基因的扩增

Fig.1 Amplification of CctA gene

2.2 pMD19-T-CctA质粒的PCR鉴定

以pMD19-T-CctA作为模板，PCR鉴定得到与预期目的片段大小相同的CctA基因片段，目的基因大小为519 bp(图2)。

M.DNA 标准DL 3 000 ；1～2.pMD19-T-CctA PCR产物

M.DNA Marker DL 3 000; 1-2.PCR products of 19-T-CctA

图2 pMD19-T-CctA质粒的PCR鉴定

Fig.2 PCR identification of pMD 19-T-CctA

2.3 重组质粒pMD19-T-CctA的PCR及双酶切鉴定

将初步鉴定的重组质粒，以XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切鉴定，PCR鉴定得到2条与预期相同的2 692 bp和519 bp目的片段，获得了重组质粒pMD19-T-CctA(图3)。

2.4 pcDNA3.1-CctA重组表达质粒PCR鉴定

以重组质粒作为模板，P1、P2作为引物，PCR鉴定得到与预期目的片段大小相同的CctA基因片段，目的基因大小为519 bp(图4)。

2.5 pcDNA3.1-CctA重组表达质粒的双酶切鉴定

将PCR初步鉴定为阳性的重组质粒pcDNA3.1-CctA，以BamHⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，37℃条件下酶切2 h，分别得到5 428 bp和519 bp两条目的片段(图5)。

M.DNA 标准DL 3 000 ；1～4.pMD19-T-CctA双酶切产物

M.DNA Marker DL 3 000; 1-4.Double enzyme digestion products of pMD 19-T-CctA plasmid

图3 pMD19-T-CctA质粒双酶切鉴定

Fig.3 Double enzyme digestion of pMD19-T-CctA plasmid

M.DNA标准DL 3 000 ；1.pcDNA3.1-CctA产物

M.DNA Marker DL 3 000; 1.PCR products of pcDNA3.1-CctA

图4 DNA3.1-CctA质粒的PCR鉴定

Fig.4 PCR identification of pcDNA3.1-CctA

M.DNA标准DL 10 000；1.pcDNA3.1-CctA质粒双酶切产物

M.DNA Marker DL 10 000 ; 1.Double enzyme digestion products ofpcDNA3.1-CctA plasmid

图5 pcDNA3.1-CctA质粒的双酶切鉴定

Fig.5 Double enzyme digestion of pcDNA3.1-CctA plasmid

2.6 pcDNA3.1-CctA质粒CctA基因的表达鉴定

将Vero细胞铺板培养，待细胞生长状态良好且铺至板底约60%～80%方可转染，分别将pcDNA3.1-CctA重组质粒和pcDNA3.1空质粒转染到Vero细胞中，进行免疫荧光检测，显微镜下观察(图6)，pcDNA3.1-CctA组细胞可观察到绿色荧光，pcDNA3.1空质粒组和Vero细胞组未观察到绿色荧光，说明重组质粒中的CctA基因能够成功在Vero细胞中表达。

3 讨论

本试验对延边气肿疽梭菌CctA基因的核苷酸序列进行同源性比对，发现核苷酸序列的同源性为99.4%，氨基酸序列的同源性为98.8%，为单克隆抗体的制备及核酸疫苗的研制奠定了一定的基础。真核表达载体pcDNA3.1含有CMV启动子，并具有多克隆位点、AMP+抗性基因及BGHpolyA加尾信号和SV40早期启动子，这样既可保证目的基因CctA长期稳定的表达在Vero细胞中，同时也可以提高表达概率，防止在后续转染细胞过程中丢失质粒[13-15]。在扩增的CctA基因特异性引物中引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，更好地连接了基因片段和表达载体。将pcDNA3.1载体引入一个内含子，满足了今后pcDNA3.1-CctA质粒用来做DNA疫苗对内含子的需求。真核细胞内外源基因表达的过程中，本试验以LipofectamineTM2 000为转染试剂，通过间接免疫荧光发现pcDNA3.1-CctA质粒可在Vero细胞中成功表达。

A.pcDNA3.1-CctA；B.pcDNA3.1空质粒对照；C.正常细胞对照A.Recombinant plasmid pcDNA3.1-CctA; B.Eukaryotic expression vector pcDNA3.1 control; C.Vero cell control 图6 间接免疫荧光检测CctA基因的表达(200×)

目前有关核酸疫苗在人类及动物产生预防和治疗作用的研究报道及关注度不断增加，应用范围也逐渐扩大。人们急迫地期望用核酸疫苗来治疗诸如微生物感染性疾病、寄生虫病等顽症，并应用于肿瘤、遗传病和其他多种疾病的基因水平治疗，并在多方面进行了大量的研究。非病毒微生物在感染宿主时，非病毒微生物蛋白都由微生物本身表达，而不是通过宿主细胞表达，因此核酸疫苗免疫机体后，在真核细胞内表达的非病毒微生物蛋白有可能产生不同类型的非自然感染状态下的蛋白。但是迄今为止的试验表明，向动物体内注射编码非病毒微生物蛋白的核酸疫苗后，非病毒微生物蛋白可在注射部位原位表达，引发保护动物免受非病毒微生物攻击的免疫反应。目前，成功用于防治非病毒微生物引起的疾病主要有结核病、肺炎支原体感染、肺炎球菌感染、幽门螺旋杆菌感染、破伤风梭菌感染、考德里立克次体感染等。从目前的试验结果来看，核酸疫苗的预防效果也存在着种种不足，其具体的机制仍需要进一步的研究阐明。