超声波辅助提取栝楼叶蛋白的最佳工艺条件*

刘爱良，段绍雄，熊利芝

(1.益阳市第十六中学，湖南 益阳 413000；2.益阳市第一中学，湖南 益阳 413000；3.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000)

栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim)为葫芦科栝楼属下的一个种.[1]栝楼全身是宝，国内外对栝楼的研究主要集中在栝楼皮、籽、根等方面.[2-3]栝楼皮具有润肺化痰、利气宽胸及抗缺氧作用；栝楼籽具有下气润肺，消结痰的功效；栝楼根也即天花粉，是滋阴清热生津、清热泻火、排脓消肿的良药.[3-4]目前，对栝楼叶的研究报道比较少.栝楼叶含有丰富的叶蛋白.叶蛋白中含有18种氨基酸,其中8种人体必需氨基酸的含量比较高，是优质的“功能性蛋白质”.[5-7]

本课题以栝楼叶为原料，利用碱液和超声波独特的优势提取叶蛋白.通过单因素实验和正交实验，筛选出最佳的提取工艺条件，以期栝楼叶蛋白的进一步开发利用提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

主要实验材料和化学试剂有：栝楼叶，湖南湘西保靖栝楼生产基地提供；牛血清蛋白，北京奥博星生物技术有限责任公司出品，生产批号20131021；G250型考马斯亮蓝，国药集团化学试剂有限公司出品；分析纯氯化钠和氢氧化钠，天津石英钟厂霸州市化工分厂出品；分析纯浓磷酸，成都金山化学试剂有限公司出品.

主要仪器与设备有：紫外可见分光光度计，UV-2550型，日本岛津公司生产；数控超声波清洗器，KQ-250DE型，昆山市超声波仪器有限公司生产；离心沉淀器，800型，上海手术器械厂生产；酸度计，pHS-3C型，上海雷磁仪器公司生产.

1.2 实验方法

将栝楼叶晒干后，置于60 ℃烘箱中烘至恒重.用FW100高速万能粉碎机粉碎，并过40目筛.混匀后置干燥环境中密封保存备用.

称取适量经预处理后的栝楼叶粗粉，按一定料液比、提取温度、超声功率和pH值置于超声清洗器中处理一定时间，然后离心，取上清液定容，弃去残渣.参照文献[8-9]中考马斯亮蓝法测定计算栝楼叶蛋白提取率.

实验考察各单因素对叶蛋白提取率的影响，在此基础上，通过正交实验对提取工艺条件进行进一步的优化.采用 Microcal Origin7.5 软件处理数据并作图，同时添加标准误差.所有实验至少重复3次.

表1和表2分别列出相关实验条件和因素水平设计.

表1 单因素实验参数Table 1 Parameters of Single Factor Test

注：①实验标准变量.

表2 正交实验因素水平表Table 2 Factors of Orthogonal Test

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 超声时间对栝楼叶蛋白提取率的影响 结果如图1所示.从图1可以看出，提取时间为10～40 min时，栝楼叶蛋白提取率随超声时间的延长而增加，且在40 min时达到最大值.因此，超声时间为40 min时提取效果最佳.

2.1.2 料液比对栝楼叶蛋白提取率的影响 结果如图2所示.由图2可以看出，在料液比1∶5至1∶15之间，随着料液比液份的增大，栝楼叶蛋白提取率逐渐增大；在料液比1∶15至1∶20之间，叶蛋白的提取率增速放缓；当料液比为1∶20时提取率最高，超过1∶20时，提取率开始下降.值得指出的是，当料液比过大时会消耗大量的水，增加成本[10].因此，料液比为1∶20时提取效果最佳.

图1 提取时间对叶蛋白提取率的影响Fig. 1 Effect of Extraction Time on Leaves Protein Yield

图2 料液比对叶蛋白提取率的影响Fig. 2 Effect of the Ratio of Material to Liquid on Leaves Protein Yield

图3 超声功率对叶蛋白提取率的影响Fig. 3 Effect of Ultrasonic Power on Leaves Protein Yield

2.1.3 超声功率对栝楼叶蛋白提取率的影响 结果如图3所示.由图3可以看出，当超声功率为125～150 W时，叶蛋白的提取率随着功率的增加而增大；当功率为150 W时，叶蛋白的提取率达到最大值；当超声功率为150～225 W时，栝楼叶蛋白提取率随着超声功率的增加而逐渐下降.这可能是因为当功率大于150 W时，超声功率会导致栝楼叶蛋白质分子某些次级键被破坏，从而发生变性，表现为蛋白溶解度下降.[11]因此，当超声功率为150 W 时提取效果最佳.

图4 NaCl浓度对叶蛋白提取率的影响Fig. 4 Effect of NaCl Concentration on Leaves Protein Yield

2.1.4 NaCl浓度对栝楼叶蛋白提取率的影响 结果见如图4所示.由图4可以看出，NaCl浓度对栝楼叶蛋白提取率具有较大影响.当NaCl浓度为0.2 ～0.5 mol/L时，提取率随着NaCl浓度的增大明显提高；当NaCl浓度为0.5 mol/L时提取率最大；当NaCl浓度超过0.5 mol/L时，叶蛋白提取率降低.因此，NaCl浓度为0.5 mol/L时提取效果最佳.

2.1.5 温度对叶蛋白提取率的影响 结果如图5所示.从图5可以看出，在25～55 ℃的温度范围内，叶蛋白提取率随温度的升高而增大；当温度为55 ℃时，提取率达到最大值；温度超过55 ℃时，随着温度的继续增加，提取率反而下降.因此，当温度为55 ℃时提取效果最佳.

2.1.6 pH值对叶蛋白提取率的影响 结果如图6所示.从图6可以看出，在提取液8～10的pH值范围内，叶蛋白提取率随pH值的增加而增大；当pH值为10时，提取率达到最大值；当pH值超过10时，随着pH值的继续增加，提取率反而降低.因此,当提取液pH值为10时提取效果最佳.

图5 温度对叶蛋白提取率的影响Fig. 5 Effect of Temperature on Leaves Protein Yield

图6 pH值对叶蛋白提取率的影响Fig. 6 Effect of pH on Leaves Protein Yield

2.2 栝楼叶蛋白质提取工艺的优化

2.2.1 正交实验设计及实验 在单因素实验的基础上，选择提取温度、提取时间、超声功率和料液比4个因素，以叶蛋白提取率为评价指标，设计正交实验.实验设计及结果列于表3.

表3 正交实验结果Table 3 Results of Orthogonal Experiment

由表3可知，影响超声波辅助提取叶蛋白的因素主次排列为料液比、NaCl浓度、超声功率、提取温度，得最佳工艺条件组合为A2B2C2D3.

2.2.2 最佳工艺条件验证 采用正交实验中的最佳工艺条件验证实验.在氯化钠浓度0.5 mol/L、提取液pH值10、提取温度55 ℃、超声功率175 W、料液比1∶25(g∶mL)的最佳工艺条件下，提取40 min，离心，取上清液测定蛋白质的含量并计算蛋白质提取率.平行提取3次，提取率分别为23.36%，23.18%，23.26%，平均提取率23.26%，表明该工艺条件稳定性好，重现度高.

3 结论

采用超声波辅助提取栝楼叶蛋白，以碱液作为提取液，在单因素实验基础上，通过正交实验对工艺进行优化，得到最佳工艺条件为：提取时间40 min，料液比1∶25 (g∶mL)，超声功率150 W，NaCl的浓度0.5 mol/L，提取温度55 ℃，提取液pH值10.在此工艺条件下，栝楼叶蛋白的平均提取率为23.26%，工艺条件稳定.栝楼叶的蛋白质含量较丰，可与广泛用于生产叶蛋白制品的苜蓿叶(18%～24%)[12]甚至与大豆(27%)[13]相媲美.