温肾养血方提高高龄雌鼠卵母细胞质量和胚胎发育潜能的研究

辛明蔚 何军琴* 贾朝霞 武 颖 张 莹 杨 维 尹晓丹

(1.首都医科大学附属北京妇产医院中医科, 北京 100026； 2.首都医科大学附属北京妇产医院群体保健科, 北京 100026)

近几年，生活压力大，精神紧张焦虑，熬夜、吸烟等不良生活习惯严重损害女性卵巢功能，并且卵巢的寿命比机体其他器官短并且衰老速度快。卵巢功能减退及其引发的不孕症已成为目前严重困扰现代女性的重大医学问题。对女性来说，卵巢衰老与生育能力、围绝经期及心血管症状等多种慢性疾病有关，所以亟需明确卵巢功能减退的生理及病理机制并确定有效的治疗方案。研究[1-2]表明中医药在促进卵泡的发育、提高子宫内膜容受性及减少西药的不良反应等方面具有显著优势，但其作用机制尚不明确。本研究借助现代医学有关卵巢功能减退发病机制的认识及检测手段，探讨温肾养血方提高卵母细胞质量和胚胎发育潜能的作用机制，为中西医结合治疗高龄女性不孕症提供可靠的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物与仪器

中药饮片购自北京同仁堂股份有限公司。温肾养血方为首都医科大学附属北京妇产医院赵松泉主任医师自拟方：柴胡、香附、木香、赤芍、泽兰、益母草、牛膝、鸡血藤、红花、丹参、当归、川芎、蒲黄、熟地、淫羊藿、山茱萸、菟丝子、枸杞子、覆盆子、鹿角、羌活、细辛、肉苁蓉等。温肾方：肉苁蓉、鹿角、淫羊藿、菟丝子、枸杞子、覆盆子。养血方泽兰、益母草、牛膝、鸡血藤、红花、丹参、当归、蒲黄、赤芍、川芎、木香、香附。中药在首都医科大学中医药学院中药制剂实验室，水煎后浓缩成药液，4 ℃冰箱储存备用。孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)(以色列Prospec公司，货号：HOR-272)；人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin， HCG)(以色列Prospec公司，货号：P139079)。37 ℃孵育箱，体视镜，细胞培养皿，1.5 mL 离心管 (eppendorf,EP)。

1.2 实验动物及分组方法

SPF级8月龄ICR雌性小鼠，20 只，体质量 40 g 左右；8～9周龄ICR 雄鼠5只，体质量22 g左右，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0002。

将实验动物采用数字表法随机分为对照组、PMSG组、A、B、C共5组(A：温肾养血组、B：温肾组、C：养血组)，根据结果进行调整，使5组动物数量相等，每组4只，能满足统计需要。

1.3 给药及取材方法

参考文献[3]连续每日定时(下午6时)灌胃给药10 d，第11天对PMSG组、温肾养血组、温肾组、养血组雌鼠同时腹腔注射PMSG 10 IU/只，对照组雌鼠同时注射200 μL 0.9%(质量分数)氯化钠注射液，48 h后，腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)10 IU/只，并于注射HCG后14 h。各组小鼠剖腹取出小鼠卵巢及输卵管，以无菌针头轻轻划破输卵管壶腹部收集卵丘复合物，评估卵细胞质量，同时对卵细胞形态进行评价，立即以80 IU/mL的透明质酸酶处理卵丘复合物，剔除卵母细胞周围的卵丘细胞，用吸卵管反复吹打后，将处理好的卵母细胞移入含10%(体积分数)血清替代补充成分(synthesis serum substituent, SSS)的改良人输卵管液 (modified human tubal fluid,mHTF)培养液中反复洗涤6次后，选形态较好的MⅡ期卵母细胞，置于含10%(体积分数)SSS的HTF培养液，放入37 ℃，5%(体积分数)CO2培养箱中备用。

1.4 获取精子

取8～9周龄ICR 雄鼠，剖开阴囊，取出附睾及输精管，于含10%SSS的mHTF培养液中撕裂，使精子游出，并于37 ℃，5%(体积分数)CO2培养箱中培养1 h获取备用。

1.5 体外受精和培养

用上游法优化精液，在培养箱中获取1.0～1.5 h。将成熟卵母细胞移入受精滴，以(2～5)×106/mL个活精子进行受精4～6 h, 在显微镜下观察有原核产生即为受精成功。

1.6 胚胎发育指标观察

1.6.1 受精情况观察

受精观察根据卵母细胞有无第二极体排出以及透明带周围有无精子附着判断卵母细胞有无受精。若培养48 h未见第二极体排出及原核形即判定为卵母细胞未受精。计数每只鼠的受精卵细胞数、卵细胞总数、正常卵裂球数。受精率=受精卵细胞数/卵细胞总数，卵裂率=正常卵裂球数/受精卵总数。

1.6.2 各组不同培养时间胚胎细胞数的观察

计数每只鼠的2 细胞率、4细胞率、8细胞率、桑葚胚率、囊胚率的数量。2 细胞率=达到 2 细胞数/受精卵细胞数；4 细胞率=达到 4 细胞数/受精卵细胞数；8 细胞率=达到 8 细胞数/受精卵细胞数；桑葚胚率=达到桑葚胚数/受精卵细胞数；囊胚率=达到囊胚数/受精卵细胞数。

1.7 采用定量即时聚合酶链锁反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术检测卵母细胞和受精卵的线粒体脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)

1.7.1 单个卵细胞DNA提取及引物设计

取单个卵母细胞或胚胎分装于0.2 mL薄壁PCR管中，每管各加20 μL去离子水，液氮反复冻融次裂解细胞释放备用。引物根据基因库公布的人线粒体基金组中ND1基因序设计，上游引物：5′-CCCGCTCTACCTCACCAT-3′； 下游引物：5′-GCCCATTTCTTCCCATTT-3′(由苏州鸿讯生物科技有限公司合成)。

1.7.2 定量PCR标准品制备

以上述方法裂解单个卵母细胞所得DNA为模板，在20 μL体系中加入12.5 μL PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)上、下游引物各1 μL，标准样本或待测样本模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL；95 ℃ 5 min预变性，95 ℃ 30 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s，在72 ℃采集荧光信号，共40个循环，最后72 ℃延伸5 min；3%(质量分数)琼脂糖凝胶, 100 V恒压电泳, 紫外分析仪下观察扩增产物。

1.7.3 线粒体DNA拷贝数测定

以SYBR Green法定量PCR技术测定各组卵母细胞和受精卵线粒体DNA拷贝数(ABI7300)。

在20 μL体系中加入12.5 μL SYBR Green PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)，上下游引物各1 μL，标准品或待测样本模板DNA 2 μL， ddH2O 8.5 μL进行荧光定量PCR反应：95 ℃ 5 min预变性，95 ℃ 30 s, 60 ℃ 20 s, 在72 ℃采集荧光信号，共40个循环，最后72 ℃延伸5 min。根据所得标准曲线计算出各组卵母细胞和受精卵线粒体拷贝数。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 不同给药组小鼠受精率和卵裂率

5组间受精率经列联表χ2检验表明差异有统计学意义(χ2=13.496，P=0.009)；组间两两比较，温肾养血组与对照组、温肾组和养血组比较差异均有统计学意义(χ2=8.409，P=0.004；χ2=3.847，P=0.050；χ2=4.670，P=0.031)。5组卵裂率，差异有统计学意义(χ2=21.070，P=0.000)，进行两两比较，温肾养血组与对照组、温肾组和养血组比较，差异均有统计学意义(χ2=3.940，P=0.047；χ2=5.726，P=0.017；χ2=8.542，P=0.003)。温肾养血组、温肾组、养血组的受精率和卵裂率明显高于PMSG组和对照组(P<0.05)，温肾养血组的受精率和卵裂率最高(P<0.05)，详见图1。

图1 不同给药组小鼠的受精率和卵裂率Fig.1 Fertilization rate and cleavage rate of mice in different drug administration groupsA：Wenshen Yangxue decoction；B：Wenshen decoction；C：Yangxue decoction；PSMG：pregnant mare serum gonadotropin.

2.2 各组不同培养时间胚胎细胞数的观察

经列联表χ2检验表明，2细胞期(χ2=12.583，P=0.014)，4细胞期(χ2=9.671，P=0.046)，8细胞期(χ2=10.080，P=0.039)，桑葚胚期(χ2=10.072，P=0.045)，囊胚数(χ2=9.985，P=0.041)，差异均有统计学意义。与受精率和卵裂率相一致，温肾养血组与PMSG组相比在2细胞期、4细胞期、8细胞期、桑葚胚期和囊胚期的发育差异有统计学意义(P=0.001，P=0.008，P=0.006，P=0.009，P=0.008)，详见图2。

2.3 各组对卵母细胞线粒体DNA拷贝数的影响

以SYBR Green法定量PCR技术测定各组卵母细胞和受精卵线粒体DNA拷贝数,标准曲线见图3，标准品倍比稀释拷贝数梯度为2×105至7×107(copies/μL)，反应所得标准曲线回归系数R2=1，表明实验数据可靠。根据反应所得标准曲线及各样本反应2-△△CT值，获得各组卵母细胞中线粒体DNA拷贝数(F=60.072，P<0.001)，差异有统计学意义。温肾养血组线粒体拷贝数平均值1.78×105与对照组线粒体拷贝数平均值1.56×105(copies/μL)相比，差异有统计学意义(P<0.01)。相对于对照组，其他各组的线粒体DNA拷贝数均明显提高，其中温肾养血组的线粒体DNA拷贝数最高，详见图3，4。

图2 各组不同培养时间对胚胎细胞数的观察Fig.2 Observation on the number of embryonic cells in different culture timeA：Wenshen Yangxue decoction；B：Wenshen decoction；C：Yangxue decoction；PSMG：pregnant mare serum gonadotropin.

图3 卵母细胞线粒体DNA拷贝数检测标准曲线Fig.3 Oocyte mitochondrial DNA copy number detection standard curve

图4 不同给药组小鼠卵母细胞线粒体DNA拷贝数的统计Fig.4 Statistical results of oocyte mitochondrial DNA copy number in mice of different drug administration groups*P<0.05， **P<0.01 vs control group;A：Wenshen Yangxue decoction；B：Wenshen decoction；C：Yangxue decoction;PSMG：pregnant mare serum gonadotropin.

2.4 各组对受精卵线粒体DNA拷贝数的影响

在检测卵母细胞线粒体DNA拷贝数变化的基础上，进一步对各组受精卵细胞线粒体DNA拷贝数进行了检测，结果见图4。经方差分析结果表明小鼠受精卵线粒体DNA 拷贝数不同组间差异有统计学意义(F=40.359，P=0.000)。与卵母细胞的检测结果相似，相对于对照组组，其他各组的线粒体DNA拷贝数均明显提高，提示温肾养血方及温肾方和养血方在卵母细胞受精后，同样可以通过提高线粒体中ATP的积累，为受精卵的发育提供能量保障。此外，同样与卵母细胞的检测结果相似，温肾养血方的线粒体DNA拷贝数2.86×105copies/μL最高，进一步说明温肾养血方在提高线粒体DNA拷贝数方面的作用效果更佳。

图5 不同给药组小鼠受精卵线粒体DNA拷贝数检测结果Fig.5 Mitochondrial DNA copy number detection results of different groups of fertilized eggs*P<0.05, **P<0.01 vs control group；A：Wenshen Yangxue decoction；B：Wenshen decoction；C： Yangxue decoction； PSMG：pregnant mare serum gonadotropin.

3 讨论

“女子七岁肾气盛，齿更发长；二七而天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子，五七阳明脉衰，面始焦，发始堕；六七任脉衰于上，面始焦，发始白；七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也”。《素问·上古天真论》[4]这段经文提出了天癸的至与竭和肾气的盛衰密切相关且年龄是天癸至、盛、衰、竭的唯一且关键因素。五七以后，肾精、肾气逐渐衰少，天癸亦随之衰减渐至衰绝。没有了天癸的激发作用，生殖机能逐渐衰退，生殖器官日趋萎缩，最后丧失生殖机能而进入围绝经期。因此，肾的功能关系到人的生殖机能，是人类生育繁衍的根本。女子“以血为本，以血为用”，冲为血海，任主胞胎，脏腑之血皆归冲脉。冲任之本在肾，肾气亏虚，冲任不充，天癸竭，无血可下，可导致肾虚血亏卵泡不能得到充足的滋润、濡养，难以发育成为成熟卵泡；肾精匮乏，不能化生为血，血脉空虚不盈，必然导致卵泡发育不良，卵子老化。肾虚则冲任不充，血虚则冲任不畅，气血无以顺利下行，故肾虚可以致血虚，因虚又可致瘀，而瘀阻脉络，又有碍肾气的生化、肾阳的鼓动、肾阴的滋养，而加重肾虚。因虚致瘀，因瘀加重虚，互为因果而形成恶性循环。因此，高龄女性卵子老化的病机肾虚为本，血虚血瘀为标。

血贵充盈，喜畅通。血的满盈，是其发挥营养作用的前提。反之，血量不足，致使“其脉空虚”(《灵枢·决气》[4])，血营养作用则无从发挥。血宜温而不宜寒，温则流动。《妇人大全良方·调经门》[5]中阐述：“血性得温则宣流，得寒则涩闭。”因此，在临床上常采用标本兼治之法，即温肾以治其本，养血以治其标。精血之源在于肾，肾为人身之化机，温肾以化精生血，温肾方药可使肾气得充，气旺血生，增强活血通络之功；寓活血于养血中，可使气机调畅，瘀血祛除，与有利于温肾方药功效的发挥。

近年来高龄女性要求生育的意愿增强，胚胎流产和畸形的风险增加，如何提高高龄女性的生育能力也成为探讨的热点和重点问题。卵母细胞数量和质量决定了卵巢储备功能。卵母细胞数量随年龄增长逐渐减少且不可再生，因此卵母细胞质量是决定卵母细胞成熟、受精和胚胎发育的关键因素[6-7]。衰老造成的卵母细胞退化是女性生育能力下降的主要因素[8]，是造成不孕和反复流产的主要原因。线粒体功能的减退与衰老密切相关[9]。人成熟的卵母细胞是人体内线粒体含量最多的细胞，有超过十万个线粒体。线粒体是细胞中重要的能量工厂，为卵母细胞成熟、精卵结合及胚胎发育等生命活动提供必要的代谢产物。人成熟卵母细胞中每个线粒体含有1～2个线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)，而mtDNA拷贝数范围在3万～100万，在卵母细胞中mtDNA拷贝数与受精、胚胎发育潜能成正相关[10-11]。mtDNA复制是受到严格调控的，如果卵母细胞发育成熟过程中复制障碍或者着床前过早恢复复制均会影响胚胎发育[12]。与细胞核DNA相比，mtDNA因缺乏组蛋白的保护和必要的损伤修复系统[13]，且处于高自由基的环境中，更容易突变或受损，从而影响受精率和胚胎发育潜能。同时其形态及分布也在卵母细胞发育的过程中产生显著的变化，因此认为，线粒体的各项指标是衡量卵母细胞胞质成熟的标志。

因卵母细胞成熟后 (MⅡ期)mtDNA停止复制，直至囊胚期才恢复，胞质中的线粒体对胚胎的发育显得尤为重要。在哺乳动物发育过程中，因为受精过程中精子的线粒体被破坏了，所以胚胎中的线粒体全部依赖于卵母细胞，MII期的卵母细胞与受精卵含有同样的mtDNA，卵母细胞线粒体的功能对早期胚胎质量产生重要影响，决定着胚胎质量[10]。受精失败和低质量的卵母细胞中mtDNA的拷贝数明显低于正常卵母细胞[14]。排卵后，卵母细胞线粒体的能量供应才开始启动，并在卵母细胞和胚胎的不同发育阶段产生显著的形态学和分布上的变化，为重要的生物学事件“定点”提供能量供应。同时，线粒体还具有DNA的半自主细胞器，mtDNA复制的保真度受到各种辅助生育技术(assisted reproductive technology,ART)手段和女性年龄的影响，并与凋亡程序的启动密切相关。现有研究表明，控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH)及其他ART治疗方法，可以直接干扰卵母细胞线粒体的功能，可能使COH 及ART的胚胎与自然排卵及体内受精的胚胎不同。因此，线粒体功能正常象征着卵母细胞健康、质量高和具有良好的发育潜能[15]，保护和改善卵母细胞线粒体功能可以直接提高ART的成功率和安全性[16]。线粒体是细胞的“能量工厂”，参与细胞生长、分化、增生、凋亡、信号传导等细胞活动，肾阳主宰着人体一身之阳，为人体生命活动的原动力，因此温肾养血能提高线粒体mtDNA，提高卵母细胞质量和胚胎发育潜能。本研究结果显示温肾方和养血方均可提高小鼠的受精率和卵裂率，但是温肾养血方的效果最好。同样，三方均可提高小鼠卵母细胞和受精卵的mtDNA，温肾养血方的效果最显著。精血之源在于肾，肾为人身之化机，温肾以化精生血，温肾方药可使肾气得充，气旺血生，增强活血通络之功；寓活血于养血中，可使气机调畅，瘀血祛除，有利于温肾方药功效的发挥。所以与温肾方和养血方相比，温肾养血方能更好地提高卵母细胞质量和胚胎发育潜能。