超高效液相色谱串联质谱法快速测定母乳中拉贝洛尔的含量

陈宇　郑新　陈立波

[摘要] 目的 建立快速测定母乳中拉贝洛尔含量的超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）。 方法 母乳样品经甲醇-乙腈混合溶液沉淀蛋白，稀释后离心取上清液进样。色谱柱为Thermo Scientific Syncronis C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），初始流动相为0.2%甲酸溶液-乙腈（80∶20，V/V），流速为0.2 mL/min，梯度洗脱，AJS ESI正离子模式电离，多反应离子监测模式（MRM）检测，外标法定量。 结果 母乳中拉贝洛尔在1.042～104.2 ng/mL范围内线性良好（r = 0.9988），定量下限为1.042 ng/mL，准确度为92.0%～104.8%，批内、批间RSD均小于15%，提取回收率为82.2%～92.4%。 结论 本方法前处理简单、准确，专属性强、灵敏度高，可用于拉贝洛尔的乳药浓度监测。

[关键词] 拉贝洛尔；超高效液相色谱串联质谱法；乳药浓度；药物监测

[中图分类号] RTS218；O657.63 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）11（c）-0085-04

[Abstract] Objective To establish an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for rapid determination of labetalol in breast milk. Methods The breast milk sample was precipitated by a methanol-acetonitrile mixed solution， and after centrifugation， the supernatant was centrifuged for injection. The column was Thermo Scientific Syncronis C18 （100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）， the initial mobile phase was 0.2% formic acid solution-acetonitrile （80∶20， V/V）， the flow rate was 0.2 mL/min， utilizing a gradient elution program. The MS/MS detection was performed under AJS ESI+ in MRM mode， quantitatived by external standard method. Results The linear range of Labetalol was 1.042-104.2 ng/mL （r = 0.9988），with the low limit of quantitation of 1.042 ng/mL. Accuracy was 92.0%-104.8%， intra-batch and inter-batch relative standard deviations were both below 15%. The absolute recovery in breast milk was 82.2%-92.4%. Conclusion The method is simple， accurate， specific， and with high sensitivity， which can be used for concentration in breast milk monitoring of labetalol.

[Key words] labetalol； Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； Concentration in breast milk； Drug monitoring

拉贝洛尔为α、β肾上腺素能受体阻滞剂，剂型多样，是孕妇妊娠高血压常用的降压药物[1-7]。临床应用其解除妊娠因素后不能立即停药或存在血压未下降至正常的情况，产妇往往仍需要降压治疗数天甚至更长，且需要权衡服药和母乳喂养之间的利弊。虽然文献报道拉贝洛尔对母亲及乳儿影响较小[8-10]，但是盐酸拉贝洛尔片说明书[11]中哺乳期用药信息写到“乳汁中的浓度为母体血液的22%～45%，乳母慎用”。另有报道称新生儿误服拉贝洛尔可致心力衰竭[12]。为在保证产妇得到有效治疗的前提下，最大限度降低拉贝洛尔对新生儿的不利影响，有必要对拉贝洛尔乳药浓度进行监测。目前，国内外未见对母乳中拉贝洛尔含量测定的报道。盐酸拉贝洛尔[13]和盐酸拉贝洛尔注射液[14]采用高效液相色谱法HPLC测定含量，其紫外检测器在生物样本中的检测灵敏度不符合定量要求。报道的血浆中拉贝洛尔的含量测定方法主要有LC-MS/MS[15]和HPLC-FLU[16]，其需液-液萃取后濃缩富集，操作繁琐耗时。本研究拟建立用于快速测定母乳中拉贝洛尔的含量超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS），简化操作，为临床拉贝洛尔乳药浓度的监测及母婴安全用药提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1290-6460超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；XS-205DU电子分析天平（梅特勒-托利多）；KQ-250DB型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；ST16R高速冷冻离心机（美国赛默飞世尔科技有限公司）；M37610-33CN涡旋混合器（美国赛默飞世尔科技有限公司）；Synergy超纯水机（默克密理博）。

1.2 试药

盐酸拉贝洛尔对照品（中国食品药品检定研究院，生产批号：100484-201001，纯度≥99.8%）；甲醇（色谱纯，默克股份两合公司）；乙腈（色谱纯，默克股份两合公司）；甲酸（优级纯，天津市光复精细化工研究所）；超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm，密理博超纯水机制备）。

60份口服盐酸拉贝洛尔片的妊娠高血压产妇乳汁样本由玉林市妇幼保健院采集，空白乳汁样本由健康产妇提供。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

色谱条件 色谱柱：Thermo Scientific Syncronis C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：A为0.2%甲酸溶液，B为乙腈，梯度程序程序：0～3 min，20%～60%B；3～5 min，60%～90%B；5～8 min，90%B；8～8.1 min，90%～20%B；8.1～12 min，20%B。流速：0.2 mL/min；柱温：35℃；进样量：5 μL。

质谱条件 AJS ESI源正离子模式；多反应监测（MRM）扫描；干燥气温度300℃，干燥气流量5 L/min，雾化器压力45 psi，鞘气温度250℃，鞘气流量11 L/min，毛细管电压4000 V，喷嘴电压500 V；拉贝洛尔定量离子m/z 329 →310.8（裂解电压100 V，碰撞能量5 eV），定性离子为m/z 329 →161.8（裂解电压100 V，碰撞能量25 eV）。

2.2 甲醇-乙腈混合液

分别量取甲醇、乙腈适量，并按照1∶1（V/V）混合均匀，用10%甲酸溶液调节pH至4.0，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取盐酸拉贝洛尔对照品11.60 mg（相当于拉贝洛尔10.42 mg），置于50 mL容量瓶中，加甲醇-乙腈混合液溶解并稀释至刻度，得浓度为0.2084 mg/mL的储备液，置于4℃冰箱中保存。精密量取储备液0.1 mL置20 mL量瓶中，用甲醇-乙腈混合液稀释至刻度，摇匀即得含拉贝洛尔浓度为1.042 μg/mL的对照品溶液。

2.4 样品前处理

取待测母乳置于涡旋混合器中均质2 min，精密量取1 mL置于10 mL离心管中，加甲醇-乙腈混合液5 mL，涡旋1 min，超声提取 5 min，放置室温后，用甲醇-乙腈混合液稀释至10 mL，5000 r/min（RCF=4612×g）离心10 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液测定。

2.5 方法学验证

2.5.1 方法专属性 分别取空白母乳、添加了拉贝洛尔对照品溶液的空白母乳以及服药产妇的母乳，按“2.4”项的方法处理，在“2.1”项的色谱及质谱条件下测定。拉贝洛尔主要生成[M+H]+准分子离子峰m/z 329，定量离子为m/z 310.8，定性离子为m/z 161.8，保留时间为3.075 min，母乳中无内源性物质干扰，方法具有良好的专属性。见图1。

2.5.2 残留效应 精密量取1.042 μg/mL拉贝洛尔标准使用液1.0 mL置于含1 mL空白母乳的10 mL离心管中，按“2.4”项处理后以洗针进样的方式进样检测后，立即将空白母乳进样。结果在拉贝洛尔峰保留时间处未检出峰，表明样品检测不受高浓度样品残留影响。

2.5.3 標准曲线与定量下限 精密量取1.042 μg/mL拉贝洛尔对照品溶液0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.0 mL分别置于各含1 mL空白母乳的10 mL离心管中，按“2.4”项处理，分别制成1.042、5.21、10.42、26.05、52.1、83.36、104.2 ng/mL的标准曲线系列工作液。按“2.1”项的色谱及质谱条件测定，以峰面积为纵坐标，母乳中药物浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程Y=143.531824X+92.914980（r = 0.9988）。表明母乳中拉贝洛尔在1.042 ng/mL～104.2 ng/mL范围内线性关系良好，其定量下限为1.042 ng/mL，信噪比大于100。

2.5.4 精密度与准确度 精密量取空白母乳1 mL至10 mL离心管中，加入0.1、0.25、0.9 mL的1.042 μg/mL对照品溶液，按“2.4”项处理，制备成低、中、高3个浓度的质控样品，每个浓度制备6份，连续测定3批，根据当批标准曲线计算各样品的测得浓度，考察方法的精密度与准确度。见表1。批内、批间RSD均小于15%，精密度与准确度均符合“生物样品定量分析方法验证指导原则”（《中国药典》2015年版四部通则9012）。

2.5.5 提取回收率 将“2.5.4”项的质控样品进样得到峰面积A1；另取空白母乳按“2.4”项处理后取上清液，配制成对应浓度的样品进样得峰面积A2，提取回收率（%）=A1/A2×100%。结果显示，拉贝洛尔的提取回收率分别为82.2%、83.3%、92.4%。

2.5.6 基质效应 取拉贝洛尔对照品溶液用甲醇-乙腈混合液配制成与质控样品浓度一致的对照品工作液，进样得到峰面积A3，取“2.5.5”项的A2计算基质效应。基质效应=A2/A3×100%。结果显示拉贝洛尔的基质效应分别为104.4%、102.4%、101.1%，表明基质效应不影响拉贝洛尔的测定。

2.5.7 稳定性 配制低、中、高3个浓度的质控样品于-20℃保存，于第2、10、30天取出，在室温下解冻后，按“2.4”项处理，按“2.1”项条件测定，计算各样品的实测浓度与理论浓度的偏差。结果显示，各样品的偏差为-13.8%～2.7%，符合小于±15%的要求，表明母乳中拉贝洛尔在-20℃保存下，30 d内稳定。

2.5.8 含量测定 本方法成功应用于60例妊娠高血压疾病产妇泌乳后首次口服盐酸拉贝洛尔片（100 mg，q8h）母乳中拉贝洛尔的浓度监测。分别取妊娠高血压产妇泌乳后首次口服盐酸拉贝洛尔片后0.5、1、2、3、4、6、8 h一次服药时段（8 h/次）的乳汁，测定浓度后绘制药-时曲线，结果显示首次服药后2～4 h母乳中拉贝洛尔浓度最高。见图2。

3 讨论

本研究首次建立了UPLC-MS/MS法测定母乳中拉贝洛尔的含量。本方法的特异性更好，灵敏度更高，检出限比HPLC荧光检测法[16]提高了10倍，比HPLC紫外检测法[14]提高了200倍。提取液的pH=5.0时盐酸拉贝洛尔对照品在有机溶剂中超声30 min仍然不能完全溶解，调节pH=4.0时能完全溶解。提取液只用甲醇或者乙腈时，拉贝洛尔峰在液相色谱仪上峰形不好，改用甲醇-乙腈混合液后峰形得到改善，故选择甲醇-乙腈混合液作为提取液。对照品溶液在1.243 min处有1个小峰，母乳样品则没有，文献报道[17-18]拉贝洛尔有4个光学异构体，对照品溶液的小峰可能是其同分异构体，母乳样品中的峰是有生物活性的同分异构体。经峰面积归一化法计算，有活性的同分异构体的百分含量为80.8%（RSD = 0.64%，n = 6）。

生物样本在质谱分析时容易产生基质效应[19-23]，严重影响定量结果的准确度和精密度。本研究对比了消除基质效应常用的净化方法沉淀蛋白法（PPT）、液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE），最终选定沉淀蛋白质后稀释的策略[22-24]，采用甲醇-乙腈混合液直接沉淀蛋白后稀释离心，前处理不需要萃取和富集，简化了处理步骤，节约了前处理时间，提高了前处理效率，而且需要样品量少，样品采集时更容易被患者接受。“生物样品定量分析方法验证指导原则”（《中国药典》2015年版四部通则9012）推荐使用质谱检测时尽可能使用稳定同位素标记的内标物，但因其价格昂贵，购买困难，故考察基质效应对测定无明显影响后，采用外标法定量。

乳药浓度监测过程中发现，大部分妊娠高血压产妇母乳中拉贝洛尔的达峰时间为服药后2～4 h，但是个别产妇达峰时间为服药后4～6 h，某些产妇出现两个甚至多个峰浓度。这主要是由药物在体内过程的多重因素所致[25]，说明口服拉贝洛尔在母乳中的浓度存在个体差异，可利用本方法开展拉贝洛尔在母乳中浓度的临床监测[26-27]。

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（收稿日期：2018-03-12 本文编辑：王 蕾）