高速剪切-超声联合提取鸡树条荚蒾果降血糖成分的工艺研究

符群，王梦丽，李卉，吴桐

（东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040）

鸡树条荚蒾（Viburnum sargentii Koehne）为忍冬科（Caprifoliaceae）荚蒾属（Viburnum Linn.）落叶灌木，天然资源颇为丰富，主要分布于我国东北、西北、华北地区，朝鲜、日本、欧洲等地也有分布[1]，可入药治疗跌打损伤，腰酸腿疼。果实含绿原酸、儿茶素等多酚化合物、黄酮化合物、多糖类等活性成分，且含量均高于叶和茎；含16种氨基酸，其中6种为人体必需氨基酸，占总量的24.81%；多种微量元素：Fe、Cu、Zn、Mn等[1]；丰富的维生素B1、维生素B2、维生素C；此外还含有挥发油、熊果酸等萜类、生物碱类和甾体类成分[2～4]。对于其功效的研究，国内主要有抗氧化、抗炎、抑菌、止咳等，国外还有抗肿瘤、降血糖等方面的研究报道[5～7]。Kunihisa Iwai[6]等研究发现，用荚蒾果实的冻干粉喂食小鼠，其血浆中葡萄糖含量显著降低；且证实荚蒾果中含有抑制酶活性的成分为花青素3-桑布糖苷以及5-咖啡酰奎宁酸。

天然活性物质的高效提取是对原料精深加工、获得高附加值产品、实现最大利用价值的关键技术。对于活性物质的提取目前多采用单一方式如：加热回流法、索氏提取法、超声提取法等，提取效率偏低，费时且能耗大。本研究采用高速剪切-超声联合法辅助乙醇提取，高速剪切分散乳化机由定子和配有多刀头的转子组成，转速在10000～24000 r/min。机器运行时在底部形成负压，产生强烈的机械剪切效应及气蚀作用，使物料分子的运动速率骤增，在定子、转子和容器内壁之间高速往复运动[8,9]；而超声波具有特有的空化作用[13]、机械效应及热效应，可增大介质的分子穿透力[10,11]。两种提取方法协同增强对原料细胞壁破坏，使提取物有效溶出，提高得率，缩短时间和能耗。

糖尿病是一类引起各项器官损伤和功能障碍的慢性疾病，已成为世界第三大严重威胁人类健康的非传染病[12]。目前针对降血糖功效的研究主要采用体外酶抑制、细胞实验和动物实验等。

体外试验法主要利用 α-葡萄糖苷酶抑制剂和 α-淀粉酶抑制剂可有效抑制酶活，阻碍食物中碳水化合物以及糖类分解代谢，参照抑制率表征出抑制剂在体内的降血糖水平[13]。选择天然食源性原料为研究对象，不仅实现原材料的高值化加工，提高天然产物的综合利用率，而且对高血糖的干预途径进行创新性探索，具有重要的研究意义。

目前国内关于鸡树条荚蒾的研究还是以园艺、观赏类为主，对于其活性成分及功能性的研究相对较少。本文采用高剪切-超声联合法辅助乙醇提取鸡树条荚蒾果中的活性物质并测定其对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率，旨在为鸡树条荚蒾的进一步加工与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

鸡树条荚蒾鲜果：黑龙江省萝北林业局林场提供。

α-葡萄糖苷酶：上海源叶生物科技有限公司；α-淀粉酶：上海源叶生物科技有限公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）：上海源叶生物科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、氢氧化钠等均为国产分析纯。

1.2 主要仪器设备

酶标分析仪（EPOCH12）：BioTek Instruments，Inc.；数控超声波清洗器（KQ-300DE）：昆山市超声仪器有限公司；FA25高速剪切分散乳化机：上海弗鲁克流体机械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

原料去杂，45 ℃烘干，破碎为60目粉末，冷藏保存。

1.3.2 单因素试验

准确称取2 g原料粉，用70%乙醇溶液进行提取。在前期预实验基础上，选取显著影响因素：剪切转速（12000、15000、18000、21000、24000 r/min），料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50（g/mL）），提取温度（40、50、60、70、80 ℃），在270 W功率下超声40 min，剪切处理120 s。研究三组因素不同水平对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率影响，每组实验做三组平行。

1.3.3 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，采用中心组合Box-Benhnken Design设计试验、建立回归模型，得到最佳提取条件。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制率的测定方法

参照Kim J S等的方法[14～16]，略作修改。取2.5 mg/mL荚蒾果提取物100 μL于96孔板中，再加入1.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液50 μL，在37 ℃条件下孵育使酶活化，15 min后加入10 mg/mL的底物PNPG溶液50 μL，于37 ℃水浴10 min后，加入1 mol/L的Na2CO3溶液10 μL终止反应，高速震荡混合均匀，用酶标仪在波长405 nm处测定吸光度A1为样品组；测定只有荚蒾果提取物反应体系的吸光度A2为对照组，再取100 μL的磷酸盐缓冲溶液代替荚蒾果提取物，测定其吸光度A0为空白组。每组实验做5组平行，按照公式（1）计算抑制率。

1.3.5 α-淀粉酶抑制率的测定方法

参照Johnson M H等的方法，略作修改[17～19]。取2.5 mg/mL荚蒾果提取物100 μL于96孔板中，再加入1.5 U/mL的α-淀粉酶溶液50 μL，在37 ℃条件下孵育使酶活化，15 min后加入1.0%的可溶性淀粉溶液50 μL，于37 ℃水浴10 min后，加入1 mol/L的DNS溶液5 μL终止反应，高速震荡混合均匀，用酶标仪在波长540 nm处测定吸光度A1为样品组；测定只有荚蒾果提取物反应体系的吸光度A2为对照组；再取100 μL的磷酸盐缓冲溶液代替荚蒾果提取物，测定其吸光度A0为空白组。每组实验做5组平行，按照公式（1）计算抑制率。

1.4 数据处理

本文采用Excel 2016、Origin 8.6、Design-Expert 8.0.6进行绘图及数据分析、SPSS 20.0软件对数据处理及Duncans’差异显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 提取物对两种酶抑制率的单因素试验结果

2.1.1 剪切转速对酶抑制率的影响

在料液比1:30 g/mL，超声时间40 min，剪切时间120 s，提取温度60 ℃，超声功率270 W的条件下研究不同的剪切转速对鸡树条荚蒾果提取物的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的影响。结果如图1所示。

图1 剪切转速对酶抑制率的影响Fig.1 Effect of shearing speed on inhibition rate enzymes

由图1可知：随着剪切转速的增加，荚蒾果提取物对两种酶的抑制率持续上升，当转速达到 18000 r/min时均达到最大值，高速剪切乳化机转速的增加使得机械剪切效应、气蚀作用增强，使原料中降血糖活性物质逐渐溶出。此时α-葡萄糖苷酶抑制率为(64.11±1.06)%，α-淀粉酶抑制率为(50.73±0.914)%。转速进一步增强易造成物料升温使提取物失活，体系产生焦糊现象，导致酶的抑制活性下降。选择转速18000 r/min为最优值。

2.1.2 料液比对酶抑制率的影响

剪切转速18000 r/min，超声时间40 min，剪切时间120 s，提取温度60 ℃，超声功率270 W的条件下研究不同的料液比对荚蒾果提取物的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的影响，如图2所示。由图2可得料液比为1:20（g/mL）时荚蒾果提取物对两种酶产生最大抑制率：α-葡萄糖苷酶抑制率为(67.07±0.91)%、α-淀粉酶抑制率为(54.36±1.19)%。随着料液比减小，原料相对于提取溶剂的量降低，提取物在低浓度下稳定性差，导致酶抑制率降低，且试剂的大量使用带来成本的提高。因此选取料液比1:20为最佳条件。

图2 料液比酶对抑制率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on enzyme inhibition rate

2.1.3 提取温度对酶抑制率的影响

在料液比1:30（g/mL），剪切转速18000 r/min，超声时间40 min，剪切时间120 s，超声功率270 W的条件下研究不同的温度对鸡树条荚蒾果提取物的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率影响，如图3所示。

图3 提取温度对酶抑制率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on enzyme inhibition rate

由图3可得，随温度的提高荚蒾果提取物对两种酶的抑制率逐步增大，在60 ℃时达到最大值，α-葡萄糖苷酶抑制率为(65.25±0.96)%，α-淀粉酶抑制率为(49.23±1.18)%。较α-淀粉酶抑制率而言荚蒾果提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响受温度变化幅度较大。在超过 70 ℃时两种酶的抑制率均显著下降，可见过高的温度不仅影响提取物活性，同时导致竞争性杂质溶出，降低荚蒾果提取物对酶的抑制率。选取60 ℃为最佳提取温度。

2.2 响应面优化结果（1）以单因素试验为基础设计响应面试验，结果如表1所示。

表1 响应面试验设计结果Table 1 The results of response surface optimization

利用Design-Expert软件进行优化，剪切转速（A）、料液比（B）、提取温度（C）二次多项式回归拟合，得到综合抑制率对三个因素的回归方程为：

利用 Design-Expert软件进行方差分析结果见表2。由表2可得，模型的F值为37.73，p＜0.01，说明该模型极显著，失拟项的p＞0.05，不显著。R2=0.9798，校正决定系数(R2Adj)：0.9538。说明拟合度好，多项式回归方程对于实际情况来说较吻合，试验误差小，方程的显著性、可靠性高，可以反应响应值的变化。故可用回归方程对试验结果进行分析和预测。

表2 方差分析结果Table 2 Analysis of variance for quadric regression model

对回归模型显著性分析可得：A、AC、A2、B2、C2对综合抑制率有极显著的影响（p＜0.01），B、C、AB、BC影响不显著（p＞0.05）。由F值可得，各因素对综合抑制率的影响顺序为：转速（A）＞料液比（B）＞提取温度（C）。

（3）响应面图和等高线图分析

图4 转速和料液比对综合抑制率交互影响的响应面图和等高线图Fig.4 Response surface diagram and contour plots of interaction effects of speed and solid-liquid ratio on the overall inhibition rate

图5 转速和温度对综合抑制率交互影响的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface diagram and contour plots of interaction effects of speed and temperature on the overall inhibition rate

图6 料液比和温度对综合抑制率交互影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface diagram and contour plots of interaction effects of solid-liquid ratio and temperature on comprehensive inhibition rate

分析图4～6可得出剪切转速（A）、料液比（B）和提取温度（C）之间的交互作用对酶综合抑制率的影响。由图4可知，转速的响应曲面比料液比的响应曲面陡峭，说明转速对酶的综合抑制率较料液比更为显著。由图6可知，料液比和温度的变化曲面均相对平缓，可得料液比、温度对酶综合抑制率均不显著，与方差分析相符。当等高线呈密集的椭圆形和马鞍形时，说明两因素交互作用显著；呈现圆形时说明因素间交互作用不显著[11]。由图5可知，等高线密集且偏椭圆形，说明转速和温度对酶的综合抑制率的交互作用显著。由图4可知，等高线呈现圆形，说明转速和料液比之间的交互作用不显著，与方差分析结果相符。

2.3 最佳条件确定和回归模型验证试验结果

通过响应面分析得到高速剪切-超声联合法辅助乙醇提取鸡树条荚蒾果提取物对酶抑制率的最佳工艺条件为：高速剪切乳化机的转速为18630 r/min，料液比1:19 (g/mL)，提取温度60.4 ℃，超声时间40 min，剪切时间120 s，超声功率270 W。此条件下，对两种酶的综合抑制率(65.91±0.74)%，其中α-葡萄糖苷酶抑制率为(71.57±0.91)%，α-淀粉酶抑制率为(57.42±0.93)%。

为实际操作中更便于产业化控制，调整最佳工艺为：高速剪切乳化机的转速18000 r/min，料液比1:19(g/mL)，提取温度60 ℃，超声时间40 min，剪切时间120 s，超声功率270 W。在此条件下进行最优工艺的验证，得到α-葡萄糖苷酶抑制率为(72.11±0.86)%，α-淀粉酶抑制率为(56.57±1.05)%，计算得出综合抑制率为(65.89±1.03)%，与理论值接近。

2.4 对比不同提取方式的降血糖活性

根据优化结果，分别使用单一超声法：料液比1:19(g/mL)，提取温度60 ℃，超声时间40 min，超声功率270 W；单一高速剪切法：高速剪切乳化机的转速18000 r/min，料液比1:19 (g/mL)，提取温度60 ℃，剪切时间120 s分别用70%乙醇进行提取，并测定2.5 mg/mL提取物的酶抑制率。结果如表3所示。

表3 3种提取方式对酶抑制率的影响Table 3 Effect of three extraction methods on enzyme inhibition rate

由表3可知，高速剪切-超声联合法提取的荚蒾果提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率、α-淀粉酶抑制率、以及综合抑制率都有极显著的提升（p＜0.01）。不同提取方法提取的鸡树条荚蒾果提取物对综合抑制率的大小为：高速剪切-超声联合法＞单一超声法＞单一高速剪切法。高速剪切-超声联合法比单一超声法提高11.39%，比单一高速剪切法提高13.64%。

2.5 荚蒾果提取物IC50的测定及主要活性成分分析

2.5.1 荚蒾果提取物IC50的测定

图7 不同浓度的提取物对酶抑制率的影响Fig.7 Effect of different concentrations of extract on inhibition rate enzymes

采用优化的工艺条件进行提取，对荚蒾果提取物梯度稀释，测定不同浓度提取物的酶抑制率。结果如图7所示。

用IBM SPSS回归分析，得出荚蒾果提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50为0.844 mg/mL，对α-淀粉酶抑制作用的IC50为1.422 mg/mL。张晓英等[20]对绿萝花用70%乙醇浸泡过夜，超声波处理2 h得提取物的蔗糖酶、麦芽糖酶、α-淀粉酶抑制率的IC50分别为0.82 mg/mL、0.84 mg/mL、1.23 mg/mL。赵玉红[21]等对老山芹在料液比1:60、提取温度80 ℃、提取时间3 h条件下热水回流提取，得到提取物的α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50为1.37 mg/mL，α-淀粉酶抑制作用的IC50为2.45 mg/mL。与相似研究对比可知，作为一种植物资源活性物质，荚蒾果醇提物具有一定的降血糖活性，且高速剪切-超声联合提取是一种能有效地节约时间和成本的工艺方法。

2.5.2 荚蒾果提取物主要活性成分分析

采用最优的组合工艺提取荚蒾果中的活性物质，并参考文献[22～24]测定果实粉中可能存在的主要活性成分如：黄酮、多酚、多糖、花色苷、绿原酸的含量，进行分析。测定结果如表4所示。由表4可知，用高剪切-超声联合辅助醇法提取的鸡树条荚蒾果实中以总多酚、总黄酮化合物的含量为主，多糖的含量次之。初步判定荚蒾果实中酚类物质可能是降血糖的主要活性成分，而提取物成分与酶抑制的相关性研究，将在之后试验中展开。

表4 提取物主要活性成分分析Table 4 Analysis of main active components of extracts

3 结论

3.1 通过单因素和响应面优化实验，综合回归模型分析和验证试验得出60目的荚蒾果粉以高剪切-超声法辅助乙醇提取的最优工艺为：高速剪切乳化机的转速18000 r/min，料液比1:19 (g/mL)，提取温度60 ℃，超声时间40 min，剪切时间120 s，超声功率270 W。在此条件下进行最优工艺的验证，得到α-葡萄糖苷酶抑制率为(72.11±0.86)%，α-淀粉酶抑制率为(56.57±1.05）%，综合抑制率为（65.89±1.03）%。并测得α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50为0.844 mg/mL，α-淀粉酶抑制作用的IC50为1.422 mg/mL。

3.2 超声法和高速剪切法均可进行活性物质的高效提取[25,26]。超声法具有很强的分散力，可利用空化作用产生局部的高温高压以及巨大的冲击力和微射流来打开团聚的颗粒、破碎细胞壁[27]。高速剪切法是通过机器产生强大的剪切力，使得物料发生分裂、破碎并均匀分散于介质中[28]。超声波具有较强的破碎细胞外壁作用，而对于内部活性物质充分溶出不彻底[29]；高速剪切法易使成分溶出，但破碎物料耗时较长，长时间的剪切作用易造成成分氧化、糊化，活性降低[30]。基于两种方法各有利弊，本研究采用超声-高剪切联合法提取活性物质并测定提取物对两种酶的抑制率。通过两种单一提取方法分别与高速剪切-超声联合法的结果对比，得出高速剪切-超声联合法对葡萄糖苷酶抑制率、淀粉酶抑制率均有显著的提升，且显著地缩短了提取时间和能耗。本试验为活性物质的提取提供了一条新思路，为荚蒾果中有效成分的分离纯化、功能性质的研究奠定良好的基础。

3.3 综上所述，高速剪切乳化机的机械剪切效应以及气蚀作用和超声波的空化作用相互协同，能较好的提高提取效率，节约时间、降低生产成本，采用高速剪切-超声联合法辅助乙醇提取荚蒾果提取物能良好保留其降血糖活性，且显著优于单一的提取方法。在荚蒾类果的活性成分提取工艺中，通过组合设计超声及高速剪切型非标设备，可高效获得优良活性的提取物，对荚蒾属植物产业链延长、高值化产品的产业化推广应用具有指导意义。