脂肪间充质干细胞在肝损伤修复中的作用

白薛玲　范妤　郭东艳

中国是肝病大国，乙肝病毒携带者近1亿，患病人数超过2千万，每年新增肝硬化患者约30万。肝病进展到终末期，原位肝移植（OLT）是目前首选治疗方法，但肝移植存在肝源缺乏、费用昂贵、伦理学限制、患者须长期服用免疫抑制剂等问题[1]。随着再生医学和生物工程技术的不断发展，干细胞移植成为治疗肝病的新选择。骨髓间充质干细胞 （Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）和脐带间充质干细胞（Umbilical cord mesenchymal Stem Cells，UCMSCs）来源困难且移植过程伦理问题不可忽视。2001年Zuk等[2]发现，人体脂肪中也含有大量的干细胞。脂肪间充质干细胞（Adipose derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）与BMSCs相似，具有低免疫源性及多向分化潜能，且来源丰富易于获取，无免疫排斥性和伦理学限制。本文主要综述ADMSCs在肝病治疗领域的研究现况，总结其发挥肝损伤修复作用的相关机制。

1　ADMSCs的生物学特征及多向分化潜能

ADMSCs 起源于中胚层，来源丰富，约300 mL的脂肪组织通过常规分离可得到约 1×107数量的ADMSCs[3]。ADMSCs定位于血管周围，故有学者提出ADMSC是位于周围血管壁分化各个阶段中的细胞亚群[4]。也有人推测它存在于所有器官和组织的血管周围[5]。研究表明，骨髓、脐带和脂肪组织来源的MSCs形态及免疫表型无明显差异[6]。ADMSCs形态呈圆形、梭形或纺锤形，贴壁生长，经3～4代传代后圆形细胞逐渐减少，外观以梭形或纺锤形为主。ADSCs和BMSCs有许多相同的表达基因，如负责血管生成，基质重塑，有丝分裂和信号通路分化的成纤维细胞生长因子（FGF）、基质金属蛋白酶（MMPs），血小板衍生生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）等[7]。

MSCs表面抗原不具有特异性，其表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，因此国际细胞治疗学会提出了鉴定MSC的3个最低标准[8]：1）贴壁生长；2）表达CD73、CD90和CD105，不表达CD11b、CD14、CD19、CD45、CD79α或HLA-DR；3）具有分化为脂肪细胞，软骨细胞和成骨细胞的潜能。ADMSCs与BMSCs共同的标记包括 CD13、CD29、CD44、CD90、CD105 和 CD166[9]。CD49（+） CD106（-）是 ADMSCs 区别于 BMMSCs 的标志。另外，AMSCs 低表达HLA-Ⅰ类抗原，不表达HLA-Ⅱ类抗原[9]。ADMSCs 标记的表达可能取决于培养条件及培养时间，随传代次数增多，ADMSCs 可表达CD11b、CD14、CD45和CD34等造血干细胞标记[10]。流式细胞术和免疫组化等检测对确认ADMSCs有辅助作用，但目前最好的鉴定方法是多系定向诱导并进行相应检测[11]。

ADMSCs 具有跨胚层分化能力和多向分化潜能，能够分化为中胚层来源的脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和成肌细胞[12]，还可以分化为来源于外胚层的神经细胞[13]、内胚层的肝细胞[14]等多种细胞类型。大量证据表明，ADMSCs经诱导分化能够模仿几乎所有体细胞的生物和形态学特征[15]。

2　ADMSCs 对肝损伤的治疗作用

大量研究证实，ADMSCs 移植具有改善肝功能、减轻肝纤维化、修复肝脏损伤作用。其治疗机制可能通过以下几个方面实现。

2.1　分化为肝细胞

ADMSCs 经体外诱导，能够分化为肝细胞样细胞（hepatocytelike cells, HLCs），且能表达肝细胞特异性标记物。Seo 等[14]首次报道了ADMSCs 能在体外分化为HLCs，并表达白蛋白（Alb）等肝细胞特异性标记物。Agnieszka等[16]分离了6名接受胃癌切除术患者的ADMSCs，发现经肝细胞生长因子（HGF）和成纤维细胞生长因子（FGF1、FGF4）孵育后，ADMSCs表现出高度肝分化能力，表达人类肝细胞的肝脏标记。Yamamoto等[17]通过聚类分析发现由 ADMSCs分化而来的肝细胞和正常肝细胞在基因表达方面极为相似。表明 ADMSCs 经诱导可在体外分化为肝细胞，表达肝细胞特征。

Krap等[18]定义了MSCs的“归巢”特性，即能够趋向性迁移至某些特定的，特别是损伤及缺血的组织中。许多学者利用这一特性研究在肝损伤微环境中直接移植ADMSCs入肝内，自行分化为肝细胞，修复损伤的作用。Horng等[19]发现，硫代乙酰胺（TAA）诱导的肝损伤条件下，ADMSCs 通过直接经肝注射能够在大鼠肝内自行分化为人肝细胞样细胞，经移植后大鼠ALT、AST、Alb、总胆红素（TBIL）水平，肝组织病理形态逐渐趋于正常。而Guangfeng等[20]发现，ADMSCs 经肝移植入D-氨基半乳糖建立的肝衰竭模型3 d 后，没有分化为肝细胞。这些研究表明，肝损伤的微环境有利于移植的 ADMSCs 向肝组织迁移和定植。而未经诱导的 ADMSCs 能否在肝内自行分化，肝脏损伤的微环境对分化促进作用还需要进一步证实。

2.2　免疫调节作用

同BMSCs相似，ADMSCs 能够广泛参与免疫调节，主要包括抑制淋巴细胞的活化和分裂增殖[21]。Wan 等[22]发现，ADMSCs 移植可显著抑制 T 淋巴细胞增殖，并且可显著减轻移植大鼠的急性排斥反应。Higashimoto等[23]发现ADMSCs 能够通过抑制 T 细胞和巨噬细胞抑制肝炎。Mohammadzadeh等[24]报道了ADMSCs 具有调节T辅助细胞（Th）细胞亚群分化的能力，能够在抑制T细胞的同时抑制Th1，Th2和Th17细胞。表明了ADMSCs 可以抑制以T淋巴细胞为主的炎性细胞，从而避免由过度免疫反应引起的肝损伤。此外，由于ADMSCs不表达HLA-DR，抗原性低，能够诱导免疫耐受并抑制移植后的免疫排斥。

2.3　分泌营养因子

ADMSCs可分泌多种细胞因子和生长因子，如肝细胞生长因子（HGF）、白细胞介素-6（IL-6）、巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）等，通过自分泌或旁分泌的形式作用于周围细胞[25]。Reza等[26]用人ADMSCs 移植入CCl4诱导的急性肝衰竭小鼠，观察到经ADMSCs 处理的动物血清中ALT水平改善， IL-6分泌明显增多。Banas等[27]研究发现，ADMSCs能够通过分泌HGF减轻肝脏炎症，治疗肝纤维化。Yu Saito等[28]发现，ADSCs与肝细胞共培养通过分泌VEGF刺激缺血再灌注小鼠肝再生，改善肝损伤。IL-6 由肝脏巨噬细胞产生，能够在肝再生过程中起到优化作用。肝细胞再生受促血管和抗血管生长因子调节，VEGF是所有调节因子中最重要的一种，能够促进肝细胞再生，改善肝功能。HGF是肝脏损伤后肝细胞再生的激发因子，能够促进成熟肝细胞分裂，显著提高肝再生能力。研究结果表明，ADMSCs移植能够促进肝再生能力，改善肝损伤。

2.4　抑制肝纤维化

肝纤维化是肝内结缔组织的异常增生，任何肝脏损伤在肝脏修复过程中都有肝纤维化的过程。目前普遍接受的病理机制是a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的产生和增殖以及肝星状细胞（HSC）活化的结果。研究发现，ADMSCs 移植入肝纤维化大鼠体内能够降低 a-SMA 的表达，从而降解胶原纤维[19]。Yu等[29]发现，与HSCs共培养72h后，ADMSCs 能够抑制HSCs的增殖活化，促进HSCs凋亡。ADMSCs移植后经CT扫描门静脉，发现肝脏灌注增加，且VEGF表达减少，这将改善纤维化肝脏的微循环，减少进一步的损害[30]。因此，ADMSCs 移植不仅能改善肝功能生化水平，还能够减轻肝纤维化程度。

3　ADMSCs 在肝病治疗中的初步临床研究

ADMSCs 在肝病领域多集中于基础研究，初步临床研究表明ADMSCs 移植治疗晚期肝病初显成效。Yoshio等[31]从4例肝硬化患者腹部及臀部抽吸脂肪进行 ADMSCs 的分离纯化，经肝动脉输注移植入肝脏。其中3例患者在移植后的3～6个月内ALB水平显著提升，且未观察到严重不良反应。柳林等[32]报道了自体 ADMSCs 经肝动脉移植治疗肝硬化患者的临床研究。结果表明，经移植2、4、8周后，8名患者肝功能各项指标（ALT、TBIL、ALB 、PTA）均明显改善，症状明显好转，未见术后不良反应。肖克勤[33]选取晚期肝病患者11例，经肝动脉移植自体ADSCs 治疗2 周及 8 周后，各项指标（ALT、TBIL、ALB、PTA）均有明显好转，且未观察到不良反应。这初步表明ADMSCs 移植对于晚期肝病疗效确切，初步提示了自体 ADMSCs 经肝动脉移植的可行性及安全性。

4　问题与展望

ADMSCs 具有巨大的研究潜力和应用前景，逐渐成为再生医学领域研究的热点，基础和临床研究表明，ADMSCs在特定条件下既能分化为肝细胞，补充肝细胞数量，又能利用“归巢”特性定值于受损肝组织，分泌多种营养因子，抑制肝纤维化，促进肝细胞修复和再生。

然而，ADMSCs 研究时间较短，研究深度不及其他MSCs，目前仍存在许多问题亟待解决：1)ADMSCs 没有特异的免疫标记物，其分离、培养方法未标准化，因此建立统一的识别标准及分离、培养方法是ADMSCs 临床应用的关键。2)ADMSCs 向肝细胞诱导分化效果还需进一步证实，其在肝内定值的机制也需要进一步明确。3)MSCs 潜在的致瘤风险不可忽视。MSCs分泌的营养因子有利于恶性肿瘤的生长和转移[34]，其分泌的免疫抑制因子可能降低免疫系统识别和杀伤肿瘤细胞的能力[35]。有研究提示，ADMSCs 在人体内可通过趋化因子作用突变为肿瘤细胞[36]。由于ADMSCs 的自发转化问题尚存争议，临床应用前还需要大量的实验验证和全面的安全性评估。4)ADMSCs 治疗的时效性，注入细胞的数量、途径尚未统一。有研究提出，ADMSCs 经自体静脉注射有可能被困在肺微循环中[37]，且目前临床研究多为小样本，其可行性尚需大样本的随机对照研究验证。

相信随着生物工程技术的不断发展，ADMSCs 的研究逐步深入，将在不久的将来造福人类。

[1] YANG D, WANG ZQ, DENG JQ,et al . Adipose-derived stem cells: A candidate for liver Regeneration[J]. J Dig Dis ,2015,16(9):489-498.

[2] ZUK PA，ZHU M，MIZUNO H,et al. Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell -based therapies[J].Tissue Eng,2001,7(2):211-228.

[3] BOQUEST AC, SHAHDADFAR A, BRINCHMANN JE, et al.Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue[J].Methods Mol Biol,2006,325:35-46.

[4] C. S. LIN, Z. C. XIN, C. H. DENG, et al.Defining adipose tissue-derived stem cells in tissue and in culture[J]. Histol Histopathol, 2010,25(6):807-815.

[5] M. CORSELLI, C. W. CHEN, M. CRISAN, et al.Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells[J]. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology,2010, 30(6):1104-1109.

[6] HIROSHI MIZUNO. Adipose-derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration:Ten Years of Research and a Literature Review[J].J Nippon Med Sch ,2009,76(2):56-66.

[7] PERONI D,SCAMBI I,PASINI A,et al.Stem molecular signature of adipose-derived stromal cells[J].Exp.Cell Res,2008,314(3):603-615.

[8] M. DOMINICI, K. LE BLANC, I. MUELLER,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cell .The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy,2006,8(4):315-317.

[9] DE UGARTE, D. A. ALFONSO, Z.ZUK, P.A,et al.Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow.Immunol[J]. Lett,2003,89(2-3):267- 270.

[10] MITCHELL, J. B,MCINTOSH, K,ZVONIC S,et al.Immunophenotype of human adipose-derived cells:Temporal changes in stromalassociated and stem cell-associated markers[J].Stem Cells,2006,24(2):376-385.

[11] DICKER A,LE BLANC, K ASTROM G,et al.Functional studies of mesenchymal stem cells derived from adult human adipose tissue[J]. Exp. Cell Res,2005,308(2):283-290.

[12] RODRIGUEZ AM,ELABD C,AMRI EZ,et al.The human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Biochimie,2005,87(1):125-128.

[13] NAGASE T，MATSUMOTO D，NAGASE M, et al.Neurospheres from human adipose tissue transplanted into cultured mouse embryos can contribute to craniofacial morphogenesis: a preliminary report[J]. J Craniofac Surg,2007,18(1):49-53.

[14] SEO MJ,SUH SY,BAE YC,et al.Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo[J].Biochem. Biophys. Res. Commun,2005,328(1):258-264.

[15] MANDRUP S,LANE MD.Regulating adipogenesis[J]. J Biol Chem,1997,272(9):5367-5370.

[16] AGNIESZKA BANAS,TAKUMI TERATANI,YUSUKE YAMAMOTO.Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells as a Source of Human Hepatocytes[J].Hepatology,2007,46(1):219-228.

[17] YAMAMOTO Y,BANAS A,MURATA S,et al. A comparative analysis of the transcriptome and signal pathways in hepatic differentiation of human adipose mesenchymal stem cells[J].FEBS J,2008,275(6):1260-1273.

[18] KARP JM, LENG TEO GS.Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details[J].Cell Stem Cell,2009, 4(3): 206-216.

[19] HORNG-JYH HARN,SHINN-ZONG LIN,SHIH-HSIAO HUNG.Adipose-Derived Stem Cells Can Abrogate Chemical-Induced Liver Fibrosis and Facilitate Recovery of Liver Function[J].Cell Transplantation,2012,21(12):2753-64.

[20] GUANGFENG C,YINPENG J,XIUJUAN S,et al.Adiposederived stem cell-based treatment for acute liver failure[J]. Stem Cell Res Ther,2015, 6(1):1-11.

[21] LIU WH, SONG FQ, REN LN, et al.The multiple functional roles of mesenchymal stem cells in participating in treating liver diseases[J]. J Cell Mol Med, 2015,19(3):511-520.

[22] WAN CD,CHENG R,WANG HB,et al.Immunomodulatory effects of mesenchymal stem cells derived from adipose tissues in a rat orthotopic liver transplantation model[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2008,7 (1):29-33.

[23] HIGASHIMOTO M, SAKAI Y, TAKAMURA M,et al.Adipose tissue derived stromal stem cell therapy in murine ConA-derived hepatitis is dependent on myeloid-lineage and CD4+T-cell suppression[J]. Eur J Immunol,2013,43(11): 2956-2968.

[24] MOHAMMADZADEH A,POURFATHOLLAH AA,SHAHROKHI S,Et al.Immunomodulatory effects of adipose-derived mesenchymal stem cells on the gene expression of major transcription factors of T cell subsets[J].Int Immunoph armacol,2014,20(2):316-321.

[25] KILROY GE,FOSTER SJ,WU X,et al.Cytokine profile of human adipose-derived stem cells:Expression of angiogenic,hematopoietic, and pro-inflammatory factors[J].J Cell Physiol,2007,212(3):702-709.

[26] SAIDI R, RAJESHKUMAR R,SHARIFTABRIZI A,et al.Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Promote Liver Regeneration[J].J Investig Sur,2015;28(6):303-308.

[27] BANAS A,TERATANI T,YAMAMOTO Y,et al.Rapid hepatic fate specification of adiposederived stem cells and their therapeutic potential for liver failure[J].J Gastroenterol Hepatol,2009,24(1):70-77.

[28] SAITO Y, SHIMADA M, UTSUNOMIYA T,et al.The protective effect of adipose-derived stem cells against liver injury by trophic molecules[J].J Sur Res,2013,180(1):162-168.

[29] YU F,JI S,SU L,WAN L,et al.Longfeng Su.Adipose-derived mesenchymal stem cells inhibit activation of hepatic stellate cells in vitro and ameliorate rat liver fibrosis in vivo[J]. J Formos Med Assoc,2015, 114(2):130-138.

[30] YANG D,WANG ZQ,DENG JQ,et al.Adipose-derived stem cells: A candidate for liver regeneration[J].J Dig Dis,2015,16(9):489-498.

[31] SHIHA G,IBRAHIM A,HELMY A,et al.Asian-Pacific Association for the Study of the Liver (APASL) consensus guidelines on invasive and non-invasive assessment of hepatic fibrosis: a 2016 update[C]. Hepatol Int, 2016:1-30.

[32] 柳林,杨海山,孙昱,等.自体脂肪间充质干细胞对晚期肝病影响的初步临床研究[J].中国实验诊断学,2007,11(4):473-476.

[33] 肖克勤.自体脂肪间充质干细胞对晚期肝病影响的初步临床研究[J].临床医药文献杂志,2015,2(19):3947.

[34] WESSON RN,CAMERON AM.Stem cells in acute liver failure[J]. Advan Sur, 2011,45(1): 117-130.

[35] SALAMA H,ZEKRI AR,BAHNASSY AA,et al.Autologous CD34+ and CD133+ stem cells transplantation in patients with end stage liver disease[J]. World J Gastroenterol, 2010,16(42):5297-5305.

[36] PRENTICE DA,TARNE G.Treating diseases with adult stem cells[J].Science,2007,315(5810):328.

[37] HIROSHI MIZUNO,MORIKUNI TOBITA,HAKAN ORBAY.Adipose-Derived Stem Cells as a Novel Tool for Future Regenerative Medicine[J].Springer Netherlands, 2014, 12(5):165-174.