中间锦鸡儿两个逆境相关R2R3-MYB基因的克隆及功能1)

柴文娟 杨杞 朱宏 张秀娟 李国婧 王瑞刚

(内蒙古农业大学，呼和浩特，010018) (哈尔滨师范大学) (内蒙古生物技术研究院) (内蒙古农业大学)

转录因子又被称为反式作用因子，可以识别并特异性地结合基因启动子上的顺式作用元件。转录因子一般包含有DNA结合区、转录调控区、核定位信号区和寡聚化位点[1]。高等植物中的转录因子众多，由于这些转录因子在结合、转录、翻译等方面的不同，被分为多个家族，主要包括MYB类转录因子家族、bZIP类转录因子家族、WRKY转录因子家族、NAC转录因子家族以及AP2/EREBPA转录因子家族等。MYB类转录因子由于其编码的蛋白质含有一个或多个高度保守的DNA结合结构域—MYB结构域而得名。每个MYB重复序列由51或52个氨基酸组成，并形成一个螺旋螺旋-转角-螺旋的结构域，其中均匀分布的3个色氨酸残基形成一个疏水核心[2-3]。在C端和保守的DNA结合结构域之间存在一个转录激活功能域，一般由大量酸性氨基酸组成，此外还有一个不完全界定的负调节域[4]。MYB类转录因子一般依据MYB结构域的重复数量在植物中被分成4个亚类：通常包含1个MYB结构域的MYB-related亚类；包含2个MYB结构域的R2R3-MYB亚类；包含3个连续结构域的R1R2R3-MYB亚类以及4个MYB结构域的4R-MYB亚类[5-6]。拟南芥R2R3-MYB亚类有126个成员，被分为22个亚组[1]。植物中第1个MYB转录因子是1987年从玉米(Zeemays)中分离得到的Clorless I CI[7]，之后越来越多的植物MYB类转录因子被鉴定出来。

由于不能主动躲避各种恶劣的自然环境，植物在长期的进化过程中被动适应了干旱、盐碱、高温等极端的生境，同时也逐渐形成了复杂而有序的多种抗逆机制。MYB类转录因子参与了许多非生物及生物胁迫的应答过程。拟南芥AtMYB7负调控ABA信号通路中抑制萌发的关键转录因子ABI5的表达，从而影响ABA和盐胁迫下种子的萌发，与野生型相比，突变体atmyb7在种子萌发时对ABA和高盐胁迫更敏感[8]。AtMYB73受盐胁迫的诱导，敲除突变体atmyb73更耐盐，且SOS1、SOS3的表达量升高[9]。大豆(Glycinemax)GmMYBJ1基因的表达受到干旱、冷、盐及ABA的诱导，在拟南芥中过表达GmMYBJ1能提高转基因植物对于干旱和冷的耐受力[10]。GmMYB84受干旱、盐、过氧胁迫等的诱导，其过表达株系在干旱处理下的存活率高于野生型[11]。蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)MtMYB3能直接结合到MtCBF4的启动子区域，在正常条件下抑制其表达，而受冷诱导的转录因子MtMYB61则在冷胁迫下会与MtMYB3的DNA结合区互作，解除MtMYB3对MtCBF4基因的抑制从而调控植物对于冷胁迫的应答[12]。小麦(TriticumaestivumL.)TaPIMP1响应多种非生物胁迫，过表达TaPIMP1基因使小麦更能抵抗小麦根腐病(Bipolarissorokiniana)的侵害并对干旱胁迫表现出更好的耐受性，而且RD22、TLP4和PR1a等与ABA、水杨酸调控有关的基因表达上调，TaPIMP1抑制表达株系表现出对胁迫更敏感的表型[13]。

中间锦鸡儿(Caraganaintermedia)俗称“柠条”，是豆科锦鸡儿属(Caragana)植物，多年生灌木[14]。柠条根系发达，能适应干旱、盐碱等环境，在降水稀少、土壤贫瘠的恶劣条件容易存活，对维持良好的生态环境起到重要的作用[15]。柠条作为饲用料用、造纸和板材原料、防风固沙、绿化环境、保持水土、改善西部地区荒漠化现状的优良候选树种，在我国干旱及半干旱地区被广泛种植[16]。本研究从中间锦鸡儿干旱转录组数据库中克隆了两个R2R3-MYB转录因子，并分析了逆境胁迫下基因的表达水平，构建了过表达载体并转化野生型拟南芥以探究基因功能，推测其与中间锦鸡儿响应非生物胁迫的机制有关。

1 材料与方法

1.1 试验材料

拟南芥Columbia生态型(Col-0)由本实验室提供，中间锦鸡儿种子采自于内蒙古乌兰察布市四子王旗。利用70%、100%乙醇对拟南芥种子进行灭菌，晾干后加入无菌水。4 ℃避光放置3 d，种于营养土和蛭石(m(营养土)∶m(蛭石)=1∶3)的培养钵中用于后续实验，中间锦鸡儿种子可不经灭菌、低温处理，直接播种。植物培养条件为22 ℃、16 h光照/8 h黑暗、7 000～8 000 lx光照强度。

向正常生长25 d左右的中间锦鸡儿幼苗培养盘中浇入300 mmol/L的NaCl溶液进行盐胁迫。在处理0、0.5、1、3、6、9、12、24、48 h时取样。取生长20 d的幼苗进行干旱处理，取样时间为0、4、8、9、10、11、12 d，复水3 d后最后1次取样。

1.2 总RNA和DNA提取

采用TRIzol(Invitrogen)法提取总RNA；CTAB法进行DNA的提取[17]。利用Quawell公司的超微量紫外分光光度计Q5000对DNA和总RNA进行定量。通过1%琼脂糖凝胶电泳进行RNA质量的检测。

1.3 反转录与基因克隆

取1 000 ng经过纯化的中间锦鸡儿总RNA或500 ng拟南芥总RNA，利用TaKaRa公司的RTase M-MLV反转录酶，依照反转录试剂说明书进行cDNA第一条链的合成。

根据中间锦鸡儿干旱转录组库中查找的CiMYB74和CiMYB116基因序列，利用Primer premier5.0软件设计特异性引物(表1)，以cDNA第一条链进行cDNA的克隆，中间锦鸡儿基因组DNA为模板进行gDNA的克隆。基因扩增所用的Primer STAR高保真酶、LATaq酶、rTaq酶及电泳所用Marker DL5000、1 kb DNA ladder购自于TaKaRa(大连宝生物工程有限公司)。PCR反应体系：5×Primer STAR buffer(+Mg2+)10 μL，上游(CiMYB74-5′或CiMYB116-5′)和下游(CiMYB74-3′或CiMYB116-3′)引物各2 μL(10 μmol/L)，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，模板1 μL，Primer STAR酶0.5 μL，无菌水30.5 μL。反应程序参照Primer STAR说明书(TaKaRa，Cat#DR010S)，CiMYB74和CiMYB116引物退火温度分别为61 ℃和59 ℃。扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序，试验所用引物均合成于此公司。

1.4 CiMYB74基因启动子的扩增及元件分析

通过染色体步移的方法获取基因的启动子序列。根据CiMYB74和CiMYB116基因gDNA序列，设计3条同向(Anti-sense)且退火温度较高(65～70 ℃)的特异性引物，分别为SP1、SP2、SP3(表1)，与试剂盒中经过独特设计的退火温度较低的4种简并引物(AP1、AP2、AP3、AP4)进行热不对称性PCR反应，经过3轮巢式PCR即可获得已知序列的侧翼序列。具体反应依照Genome Walking Kit试剂盒(TaKaRa，Cat#6108)说明书[18]。

表1 试验所用到的引物

注：引物序列中的小写字母表示与线性化载体互补的接头序列。

1.5 CiMYB74过表达重组载体的构建及转基因植物纯合体筛选鉴定

根据CiMYB74基因的ORF序列设计特异性引物CiMYB74-HA5′和CiMYB74-HA3′，利用Primer STAR高保真酶扩增ORF区域，反应体系同前面扩增gDNA一样。通过In-Fusion(TaKaRa)连接酶将扩增片段连入线性化的pCanG-HA表达载体中，重组载体中目的基因的两端分别有SalI、SacI酶切位点，SalI、SacI双酶切后，如果得到单一的符合预期大小的目的基因条带，则证明过表达载体构建成功。在pCanG-HA载体上有3个PstI位点，如果PstI单酶切后得到3条符合预期大小的条带，则证明实验所用载体不存在问题。测序正确的重组质粒通过电转化法导入农杆菌感受态细胞GV3101中。通过浸花法转化野生型拟南芥并筛选纯合体植株，具体操作参考于[15]等的方法。通过RT-PCR或实时荧光定量PCR检测转基因拟南芥中CiMYB74基因表达情况。

1.6 萌发率试验

将CiMYB74过表达株系和野生型拟南芥种子分别点种在含有100、150、200 mmol/L NaCl以及不含NaCl的1/2 MS培养基上，以胚根突破种皮为萌发标志，每天统计各平板的萌发情况。由于100 mmol/L平板上种子萌发整体较快，在第4天进行拍照；150、200 mmol/L的NaCl平板在萌发第8天拍照。

1.7 基因数据分析

在NCBI BLAST网站中(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行基因相近序列搜索，应用Vector NTI Advance@ 11.5进行序列拼接，ClustalW进行序列比对，MEGA 5.0构建系统发育树。使用DNAMAN多序列比对查找内含子与外显子，ExPASy网站ProParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)推导氨基酸序列理论等电点与分子量，ProtScale工具(http://web.expasy.org/protscale/)进行蛋白质疏水性分析。通过NPS@网站HNN工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)预测蛋白质的二级结构。通过PlantCARE网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对基因启动子序列进行在线分析，寻找可能的顺式作用元件。

2 结果与分析

2.1 CiMYB74和CiMYB116基因克隆和序列分析

利用特异性引物扩增CiMYB74和CiMYB116的包含编码区的cDNA及gDNA序列。CiMYB74基因PCR产物进行凝胶电泳得到约1 000和2 000 bp的条带(图1A，B)，CiMYB116检测到约1 000和1 200 bp的条带(图1C，D)。

序列分析表明CiMYB74基因gDNA序列长度为1 976 bp，包含3个外显子区(1～140，250～367，1 266～1 976 bp)和2个内含子区(141～249，368～1 265 bp)；ORF长度为978 bp，编码326个氨基酸，起始密码子ATG，终止密码子TAA(图2)。CiMYB116基因ORF长900 bp，编码300个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA；gDNA长为1 270 bp，包含3个外显子(144、129、624 bp)和两个内含子(96、277 bp)(图3)。

1.CiMYB74基因cDNA扩增结果；2.CiMYB74基因gDNA扩增结果；3.CiMYB116基因cDNA扩增结果；4.CiMYB116基因gDNA扩增结果；M为DL5000。

图1CiMYB74和CiMYB116基因克隆

下划线标注部分表示内含子区域。

下划线标注部分表示内含子区域。

2.2 蛋白理化性质预测

CiMYB74和CiMYB116基因编码蛋白的理论等电点分别是6.1和6.72，预测分子质量为36.65和34.48 ku。对氨基酸序列进行亲疏水性分析，其中：CiMYB74蛋白第301位的谷氨酸(Glu)亲水性最强(具最低分值-2.7)，第174和175位的丙氨酸(Ala)、苏氨酸(Thr)疏水性最强(同时具有最高分值1.622)；CiMYB116第137位的丙氨酸(Ala)疏水性最强(具最高分值1.144)，154位的丝氨酸(Ser)亲水性最强(具最低分值，-2.467)。两条多肽链中亲水性氨基酸分布较多，表明这两个蛋白整体上是亲水的。预测了CiMYB74和CiMYB116蛋白质的二级结构，结果表明无规则卷曲、α螺旋与β折叠这3种主要的二级结构均存在于这两个蛋白中，而且均以无规则卷曲最多，CiMYB74蛋白质中的β折叠(9.51%)所占比例要高于CiMYB116蛋白(6.33%)，而α螺旋和无规则卷曲比例低于CiMYB116蛋白(表2)。

表2 CiMYB74和CiMYB116蛋白质二级结构

2.3 CiMYB74和CiMYB116基因的同源性及进化分析

根据CiMYB74和CiMYB116推导的氨基酸序列，在NCBI Blast中检索与其最相近的序列并进行多序列比对分析。结果显示CiMYB74和CiMYB116都是典型的R2R3类MYB转录因子，CiMYB74第16位到第64位氨基酸为R2结构域，第67到第115位氨基酸为R3结构域(图4)。CiMYB116第18位到第68位氨基酸为R2结构域，第71到第119位氨基酸为R3结构域；与野生大豆(Glycinesoja)GsMYB21(KHN11407.1)和大豆GmMYB340(XP_003555909.1)的相似度均为77%(图4)。

从Genebank中下载与CiMYB74、CiMYB116氨基酸序列相似的其他物种的序列，经ClustalW比对，利用MEGA5软件的邻接法构建系统发育树。聚类结果表明CiMYB74与豆科植物的一些MYB转录因子亲缘关系都很近，与鹰嘴豆(Cicerarietinum)CaMYB308-like、大豆GmMYB330-like等相似度都达到70%以上，而与非豆科植物，如葡萄VvMYB39等亲缘关系相对较远(图5)。拟南芥AtMYB41、AtMYB74及AtMYB102属于R2R3-MYB家族第11亚组，该亚组成员在R3结构域后通常包含PRLLLD基序，CiMYB74也含有PRLLLD序列(图4和图5)[1]。

黑色实线和虚线分别代表R2和MYB R3结构域，黑色方框圈出了同一亚组的保守基序。

采用邻接法构建系统发育树；Bootstrap设置为1 000次。

CiMYB116与拟南芥MYB家族中的AtMYB116的亲缘关系最近，相似度达到48%。AtMYB116属于R2R3-MYB转录因子第20亚组，该亚组成员在R3结构域后所共有的保守序列是WxPRL，CiMYB116同样含有这一序列(图4和图5)。与第11亚组其他成员相比，CiMYB74与拟南芥R2R3-MYB的其他亚组成员距离相对更远；CiMYB116则与除第20亚组外的成员亲缘关系更远(图6)。

1，5.第一轮延伸的扩增产物；2，6.第二轮延伸的扩增产物；3、4和7、8.第三轮延伸的扩增产物；M1.DL5000，M2.1kb分子质量标准。

2.4 NaCl和干旱胁迫下基因的表达

qRT-PCR检测发现，CiMYB74和CiMYB116基因转录水平的表达都受到干旱和NaCl胁迫的诱导(表3)。CiMYB74在干旱胁迫第11天时表达量达到最高值，约为处理前的230倍；CiMYB116基因的表达水平受干旱胁迫诱导呈持续上升趋势，并在复水后下降，说明该基因的表达确实受到干旱胁迫的诱导。

表3 干旱与NaCl胁迫下CiMYB74和CiMYB116的基因表达

胁迫CiMYB74处理时间/h基因表达倍数误差CiMYB116处理时间/h基因表达倍数误差NaCl01.0000 1.0000.51.1010.2410.50.8000.2341.01.6870.5041.03.0390.4883.01.6280.3673.029.7202.8706.03.2470.6559.037.0402.1479.012.2502.36524.035.6304.17024.028.3605.43548.0138.70020.690

NaCl诱导24 h时，CiMYB74基因的表达量是未处理时的36倍多；CiMYB116基因在盐胁迫48 h后，表达量上调至处理前的12倍左右。

2.5 CiMYB74和CiMYB116基因启动子的克隆与序列分析

利用染色体步移试剂盒，以中间锦鸡儿gDNA为模板，克隆基因启动子。测序结果表明，特异性引物分别与AP3、AP2配对，成功克隆到CiMYB74和CiMYB116基因起始密码子上游516和1 040 bp的启动子序列(图7)。

将获得的序列输入到启动子分析网站PlantCARE中，寻找可能存在的顺式作用元件。预测发现，CiMYB74基因启动子序列中除了具有启动子转录基本核心元件CAAT-box和TATA-box外，还含有多个光应答元件，如G-box(CACGTC)、Gap-box(AAATGGAGA)、MNF1(GTGCCCA/T)等；此外，CiMYB74启动子还包含生长素响应元件AuxRR-core(GGTCCAT)和TGA-element(AACGAC)、茉莉酸响应基序CGTCA-motif和TGACG-motif、ABA及病毒应答元件CE3(GACGCGTGTC)、厌氧诱导响应元件ARE(TGGTTT)以及响应昼夜节律振荡元件Circadian(CAANNNNATC)等(表4)。启动子顺式作用元件预测结果初步表明，CiMYB74基因可能参与非生物胁迫应答及调控植物的某些生长发育过程。

表4 CiMYB74启动子分析预测

CiMYB116启动子序列中包含有与非生物胁迫有关的顺式作用元件，如热激应答元件(HSE，heat shock element)、水杨酸应答元件(TCA-element)、参与防卫反应与胁迫应答基序(TC-rich repeat)以及响应节律振荡元件(Circadian)(表5)。除此之外，与光应答有关的元件也较多出现在CiMYB116启动子序列中，如Box-4，MRE(MYB binding site involved in light)，LAMP-element以及ATC-motif。

A.pCanG-CiMYB74表达载体的酶切验证：1.对照质粒；2.SalI、SacI酶切鉴定；3.PstI酶切鉴定；B.CiMYB74过表达株系的RT-PCR鉴定：Control+.柠条cDNA做模板的阳性对照；Control-.拟南芥cDNA做模板的阴性对照；其他数字表示过表达株系)；C.CiMYB74过表达株系的qRT-PCR鉴定(选择AtEF1α作为内参基因。结果计算采用2-ΔCT法。纵轴用对数轴表示)；M1.1kb分子量标准；M2.DL5000 Marker。

图7 pCanG-CiMYB74重组质粒的构建及过表达植物的鉴定

2.6 pCanG-CiMYB74重组表达载体的构建及纯合体植株的鉴定

利用In-Fusion酶将CiMYB74基因ORF区连入pCanG载体中，使用SalI、SacI进行双酶切，PstI单酶切验证重组质粒(图8A)。通过RT-PCR检测了转基因植物中CiMYB74的表达情况，由图可知，在10个转CiMYB74基因的纯合体株系和阳性对照(C+)中均扩增出目的基因，而阴性对照(C-)中并未有目的条带出现(图8B)。过表达植物生长过程中呈现的形态与野生型没有明显区别，根据荧光定量PCR检测结果，选取表达量最高、最低以及居中的3个过表达株系用于后续实验，即OE-1、OE-2和OE-6(图8)。

2.7 CiMYB74负调控种子萌发时对盐胁迫的响应

胁迫表达分析结果表明，CiMYB74基因的表达受到NaCl的诱导，而且很多MYB转录因子也参与植物对盐胁迫的响应过程。为了进一步了解在拟南芥中过表达中间锦鸡儿CiMYB74是否能改变拟南芥对NaCl的敏感性，分别检测了在含有100、150和200 mmol/L NaCl的1/2MS培养基上野生型和转基因株系种子的萌发情况。萌发实验显示，在含有NaCl的培养基上，过表达株系的萌发表现出对NaCl更不耐受的表型。其中，在含有200 mmol/L NaCl的培养基上，CiMYB74转基因株系的萌发被强烈地抑制(图8)。这些结果说明，CiMYB74负调控种子萌发时期对于盐胁迫的应答过程。

3 结论和讨论

本研究从中间锦鸡儿干旱转录组数据库中克隆了两个R2R3-MYB基因，分别命名为CiMYB74和CiMYB116。CiMYB74和CiMYB116基因gDNA长度分别为1 976和1 270 bp，均包含3个外显子和2个内含子；开放阅读框(ORF)长度分别为978和900 bp，分别编码326和300个氨基酸。CiMYB74和CiMYB116基因的表达都受到盐和干旱胁迫的诱导。此外，克隆得到516 bp的CiMYB74启动子序列，主要包含茉莉酸响应基序(CGTCA-motif和TGACG-motif)、ABA及病毒应答元件(CE3)、厌氧诱导响应元件(ARE)以及响应节律振荡元件(Circadian)等；克隆得到1040bp的CiMYB116启动子序列，主要包含热应答元件、水杨酸应答元件、防卫反应及胁迫应答元件。最后，在拟南芥中过表达CiMYB74，转基因株系种子在萌发时期对盐胁迫更加敏感，表明该基因负调控种子萌发时期对于盐胁迫的耐受能力。

系统进化分析发现CiMYB74基因与R2R3-MYB第11亚组的AtMYB74、AtMYB102和AtMYB41的亲缘关系较近。已有研究表明，拟南芥第11亚组成员之间功能差异较大，成员所共有的PRLLLD序列和基因功能间没有明确的关联[19]。拟南芥AtMYB74受盐胁迫诱导且通过启动子区DNA甲基化的方式负调控植物响应盐胁迫的过程；与野生型相比，AtMYB74过表达株系种子在萌发时期表现出对盐更敏感的表型，但是在含有NaCl的土壤中野生型和过表达的幼苗没有表现出明显的差别[19]。与AtMYB74不同，拟南芥AtMYB102受生物胁迫的诱导，在菜粉蝶(Pierisrapae)咬食的组织中AtMYB102表达量明显上调[20]。其突变体myb102比野生型更加不抗虫且相关防御基因表达降低，而过表达株系则更加抗虫[20]。第11亚组另一个成员AtMYB41同样也响应各种非生物胁迫，对AtMYB41过表达植物进行的转录组和代谢组分析数据表明，AtMYB41通过控制初级代谢及负调控植物对于渗透胁迫的短期转录水平上的响应来参与多种细胞进程[21]。此外，另有研究表明AtMYB41可起始拟南芥木栓质合成过程中的必须步骤，AtMYB41过表达后可促进木栓质合成相关基因CYP86A1和CYP86B1的表达而增加植物体内木栓质的积累[22]。我们的研究表明CiMYB74的表达受NaCl和干旱的诱导，而且在拟南芥中过表达CiMYB74会增强植物在种子萌发时期对盐的敏感性，这一结果与AtMYB74过表达后产生的表型基本一致[19]。分析CiMYB74启动子序列后发现，有生长素响应元件、厌氧诱导元件、茉莉酸响应元件等顺式作用元件出现，这预示着CiMYB74除了响应盐胁迫外，可能还参与了植物体内其他的一些生理生化过程。

此外，系统进化分析还表明拟南芥中与CiMYB116亲缘关系较近的有AtMYB116、AtMYB21、AtMYB112、AtMYB78和AtMYB108，其中AtMYB21属于第19亚组，其他几个成员属于第20亚组[6]。Mengiste等对拟南芥几乎所有MYB做了响应CdCl2、NaCl及各种激素处理的表达检测，其中AtMYB116、AtMYB21、AtMYB112、AtMYB78和AtMYB108基因对这些处理都有不同程度的响应[23]。AtMYB108对于拟南芥响应非生物胁迫是必须的，其突变体植株比野生型更不耐盐，干旱处理下突变体株系的存活率低于野生型[23]。Cheng等的研究表明，赤霉素和茉莉酸共同作用能影响AtMYB21、AtMYB24和AtMYB57的表达，从而促进植物雄蕊败育[24]。AtMYB112在盐胁迫和强光照下促进花青素的合成，AtMYB112基因受NaCl胁迫诱导后表达量上升[25]。棉花GhMYB108通过和类钙调素蛋白GhCML11互作使植物应对真菌胁迫，GhMYB108基因敲除突变体对轮枝菌敏感性增强，而过表达株系则表现出对该菌种更耐受的表型[26]。本研究中的CiMYB116基因在干旱及盐胁迫后，表达量都有不同程度的上调。此外，通过对克隆得到的CiMYB116基因启动子序列分析表明，该基因启动子区域包含一些非生物胁迫和生物胁迫相关的顺式作用元件，如热激应答元件(HSE)、水杨酸应答元件(TCA-element)、参与防卫反应与胁迫应答基序(TC-rich repeat)，说明CiMYB116基因可能参与了中间锦鸡儿抵御环境胁迫和病原菌的信号调控。与CiMYB116亲缘关系相近的拟南芥MYB的功能集中在抵抗非生物或生物胁迫及植物发育调控，但是R2R3-MYB类转录因子在不同物种中功能差别很大。CiMYB116的功能可能与拟南芥AtMYB21、AtMYB116或AtMYB108有所不同，具体的生物学功能还需进一步的验证。植物存在于自然界中，不能像动物一样主动躲避各种极端环境及生物胁迫，但是在长期的进化过程中，也具备了响应各种非生物胁迫的应答机制。中间锦鸡儿作为西北部干旱、半干旱地区优秀的造林树种，在多种逆境胁迫下均能生存。从中间锦鸡儿中寻找植物响应干旱、盐碱及冷冻害等非生物胁迫的基因及其调控机制，有助于深入了解植物应答逆境胁迫的分子机理。