乙酰化TLR4在GDM孕妇外周血单核细胞中的表达及意义

周爱芬

(许昌市立医院妇产科，河南 许昌 461000)

近年来妊娠期糖尿病 （gestational diabetes mellitus，GDM）的发病率一直处于高位并常伴有多项并发症，严重威胁了母婴的身体健康，故而，研究GDM的相关机制对其早期诊断并给予恰当的治疗具有重要意义，也是目前临床研究的重要方向[1]。现阶段的研究[2]认为GDM的主要病因是胰岛素抵抗(insulin resistant，IR)和胰岛功能受损。研究[3]已证实GDM孕妇体内抗炎-致炎失衡、慢性炎症状态和 Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)途径等参与了IR和胰岛功能受损的形成过程并认为TLR4过度表达导致的机体异常炎症反应状态已成为多项炎症性疾病的病理基础。

先前的研究[4]发现内毒素(lipopo-lysaccharide，LPS)-Toll样受体4(TLR4)-核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路激活诱发炎症因子分泌和释放可能参与了GDM的发病过程，蛋白质乙酰化在调控蛋白质功能上具有简单的开关作用，属于一种动态可逆的翻译后修饰。但现阶段关于乙酰化TLR4在GDM体内是否表达并发挥一定作用尚不明晰。故此，本研究深入探讨了乙酰化TLR4在GDM孕妇外周血单核细胞中的表达及在LPSTLR4-NF-κB通路中的作用，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2017年10月在我院治疗的GDM孕妇67例（GDM组），纳入标准：⑴诊断符合国际妊娠合并糖尿病研究组（IADPSG）制定的标准；⑵孕周在24～28周；⑶年龄＜35岁；⑷孕妇及家属知情同意。排除标准：⑴非单胎妊娠；⑵合并有感染、妊娠期高血压、妊娠期肝内胆汁淤积症、肝肾功能损害等疾病。同时选取健康孕妇67例作为对照组，GDM组和对照组孕妇年龄、孕周比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组孕妇一般资料比较

1.2 实验方法 采用Western blot法检测TLR4、乙酰化TLR4和NF-κB p65蛋白表达：冰上裂解细胞，分别离心后取上清置于EP管中，提取总蛋白后，取20ug总蛋白行SDS-PAGE电泳，常规转膜后5%脱脂奶粉2h室温封闭，分别加入适量对应抗体，孵育（4℃）一抗过夜，洗涤后二抗孵育，ECL发光试剂盒曝光显影。

微板法检测血清脂多糖（LPS）：阴性对照管加入100ul细菌内毒素检查水，待检管加入100ul内毒素标准溶液，供试品管加入100ul供试品，三管均加入100ul鲎试剂后混匀，37℃孵育10min，各加入100ul显色基质溶液，混匀后37℃孵育6min，各管均加入500ul偶氮试剂1溶液，混匀后各管均加入500ul偶氮试剂2溶液，混匀静置后酶标仪检测吸光度[5]。

ELISA法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）和白细胞介素-10（IL-10），试剂盒购于南京建成生物研究所，实验操作严格按照说明书进行。

1.3 统计学处理 统计分析采用SPSS 19.0软件，计量资料采用（±s）表示，两组间比较使用t检验，相关性采用Pearson相关分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组TLR4及乙酰化TLR4表达比较 GDM组和对照组TLR4蛋白相对表达差异比较无统计学意义（P＞0.05）；GDM组检测到乙酰化TLR4相对表达，而对照组未检测到乙酰化TLR4表达。见表2。

表2 两组TLR4及乙酰化TLR4表达比较

2.2 两组 LPS、TNF-α、IL-1及 IL-10比较 GDM组 LPS、TNF-α、IL-1 及 IL-10 明显高于对照组（P＜0.05），见表 3。

表3 两组LPS、TNF-α、IL-1及IL-10比较

2.3 两组 NF-κB p65表达比较 GDM 组 NF-κB p65蛋白相对表达明显高于对照组（P＜0.05），见表4。

2.4 相关分析 将GDM组乙酰化TLR4相对表达与 LPS、TNF-α、IL-1、IL-10 及 NF-κB p65 蛋白相对表达进行Pearson相关分析，结果显示乙酰化TLR4 相对表达与 LPS、TNF-α、IL-1、IL-10 及 NF-κB p65蛋白相对表达呈正相关 （r=0.321、0.304、0.335、0.341 和 0.482，P＜0.05）。

表4 两组NF-κB p65表达比较

3 讨论

GDM是于妊娠期诊断的糖耐量减低和糖尿病的总和，研究发现本病可伴发多项并发症，经资料[6，7]分析总结其对孕妇的影响主要包括；早期胚胎发育异常、感染、流产，甚至死亡，羊水过多、妊娠期高血压疾病、分娩后代谢综合征（metabolic syndrome，MS）的发生风险增加等；其对胎儿及新生儿的影响主要包括：胎儿生长受限 （fetal growth restriction，FGR）、巨大胎儿、新生儿低血糖、畸形及呼吸窘迫综合征等病症。

研究[8]认为GDM的主要病因是胰岛素受损和胰岛素抵抗，而孕妇体内炎症状态与两者的发生、发展关系密切。TLR4可诱发多种免疫炎症反应并已成为多种炎症疾病的重要生理、病理基础。资料[9]显示乙酰化是蛋白质重要的翻译后修饰过程，可调控不同的细胞质过程，并与细胞核存在重要作用，单核细胞内TLR4 mRNA表达的增加也促进了GDM的发生。Xu C[10]的研究发现TLR4蛋白是炎症通路活化的必要条件，其在翻译后可被乙酰化进而促进炎症因子的表达。LPS-TLR4-NF-κB通路属于重要的TLR4信号通路，已成为GDM发病机制的重要方向[11]。Zhang Y[12]通过对炎症因子表达与 TLR4、NF-κB mRNA的相关性分析证实LPS-TLR4-NF-κB通路的激活与GDM关系密切。但现阶段关于TLR4乙酰化在GDM体内是否表达及作用机制尚不明晰。故此，本研究深入探讨了乙酰化TLR4在GDM孕妇外周血单核细胞中的表达及在LPS-TLR4-NF-κB通路中的作用。

GDM组和对照组TLR4蛋白相对表达差异比较无统计学意义（P＞0.05）；GDM组TLR4乙酰化相对表达为（1.012±0.062），而对照组未检测到乙酰化TLR4表达，差异比较有统计学意义（P＜0.05）。上述结果说明GDM患者存在乙酰化TLR4的过度表达，并提示TLR4乙酰化可作为GDM患者早期诊断和预后评估的重要指标。

GDM 组 LPS、TNF-α、IL-1 及 IL-10 分别为（0.95 ±0.11）IU/ml、 （56.01 ±3.18）pg/ml、 （76.82 ±3.05）pg/ml和（32.17±4.07）pg/ml，明显高于对照组（P＜0.05）；GDM 组 NF-κB p65 蛋白相对表达为（0.763±0.073），明显高于对照组（P＜0.05）。 因妊娠期孕妇体内环境可出现适应性改变，患者肠道菌群可导致LPS异位进入外周循环，可诱导多种细胞的TLR4活化及独立诱导机体产生IR外，将炎症通路激活[13]。故而，GDM 患者 LPS、TNF-α、IL-1及IL-10水平高于对照组。笔者推测LPS可能通过提高乙酰化TLR4进而活化炎症通路，加速炎症因子的表达。此外，IL-10的升高幅度相对低于TNF-α和IL-1，说明GDM孕妇体内低度炎症状态可能通过增加乙酰化TLR4的敏感性从而加剧了抗炎-致炎的失衡[14]。

GDM组TLR4乙酰化相对表达与LPS、TNF-α、IL-1、IL-10及 NF-κB p65蛋白相对表达呈正相关（P＜0.05）。上述结果说明了TLR4通过翻译后的乙酰化修饰作用调控着孕妇体内LPS-TLR4-NF-κB 通路的活化程度。 LPS、TNF-α、IL-1、IL-10 升高可导致胰岛功能的损伤和IR的形成。IL-1、IL-10即是作为体内重要的抗炎细胞因子并能抑制NF-κB，发挥抑制炎性细胞分泌炎性因子的作用[15]。此外，笔者认为在研究妊娠期糖尿病的发病机制时，还要考虑妊娠这一特殊生理条件对妊娠期糖尿病的影响，妊娠期间特殊的内分泌和代谢变化是妊娠期糖尿病发生的重要因素。但本研究存在一定缺陷，本研究仅在体外环境下进行，然而人体内的复杂环境是否对乙酰化TLR4修饰产生影响，仍需要大样本研究证实。

综上所述，GDM孕妇外周血单核细胞存在乙酰化TLR4，其与炎症因子水平有一定相关性，值得进一步研究。