NF-κB和IκB-a蛋白表达水平变化与老年痴呆发病相关性分析及作用机制分析

朱登玲，姜阿利，王慧峰，刘潘，徐凤琴，王霞

(开封美宝空分医院内科，河南 开封 475002)

老年痴呆病的最主要形式为阿尔兹海默病（Alzheimer's disease，AD），约占所有老年痴呆病患者比例的60%左右，此外本病具有不可逆性和隐匿性，对患者的正常生活和家庭均带来了严重的负担[1]。AD的发病机制较为复杂，通过AD发病机制以寻找治疗和预防AD的新药已成为现阶段AD研究的重要方向。

核因子－κB （nuclear factor－kappa B，NF－κB）是具有促进基因转录功能的核蛋白因子，其激活和表达的上调可反映炎症反应、血管损伤和细胞凋亡的严重程度。NF－κB在多类神经系统细胞中均存在分布，可作为信使传递突触信号至核内而发挥调控基因转录的作用[2]。研究[3]发现痴呆大鼠海马 NF－κB和抑制和转录因子－κB （inhibitor nu鄄clear factor－kappa B，IκB）关系密切。 故此，本研究深入探讨了NF－κB和IκB－a蛋白表达水平变化与老年痴呆发病的相关性并讨论其在临床上应用的意义，现报道如下。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选取我院确诊的老年痴呆患者120例（AD组）、体检正常的健康对象50例（对照组），收集时间2013年4月－2017年3月，临床资料通过回顾患者的病历记录和病例报告获得。

AD组，男性63例、女性57例，年龄48～85岁，平均年龄 67．2±13．1 岁；恶化程度：第一阶段 37例，第二阶段49例，第三阶段34例。对照组，男性24例，女26例，年龄45～77岁，平均年龄63．1±12．2岁。两组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。

1．2 纳入排除标准

1．2．1 纳入标准[4]⑴各项检测均确诊为老年痴呆患者；⑵有完整规范的术后病理报告及随访资料；⑶无高血压、糖尿病、肾炎等疾病。

1．2．2 排除标准 ⑴合并其他系统严重疾病者。⑵未能完成随访者。⑶贫血及凝血功能障碍；⑷风湿及免疫系统疾病；⑸严重的肝肾功能疾病。

1．3 免疫组化及蛋白质免疫印迹方法 免疫组化和蛋白质印迹法检测两组对象脑脊液中的NF－κB和 IκB－a蛋白表达情况。

免疫组化法：活检患者大脑病变组织，继续固定24h，常规石蜡切片，片厚5μm；选择特异性抗体，通过免疫组织化学SP法定性分析NF－κB和IκB－a 蛋白表达情况；

蛋白印迹法：提取蛋白后BCA法检测相关浓度，10ug单孔上样进行凝胶电泳，转膜后5%脱脂牛奶90min，25℃封闭；3%脱脂牛奶混匀一抗；4℃孵育过夜；一抗孵育后清洗3次，3%脱脂牛奶混匀二抗，IgG 浓度为 1：800；90min 28℃孵育后清洗 3次，显影[5]。

1．4 免疫组化及蛋白质印迹判定标准[6]免疫组化结果判定：阴性对照用PBS代替一抗进行染色，结果做为阴性；以在呈现清晰的棕黄色颗粒为阳性，按阳性细胞所占比例数分为：染色强度分为－(阴性)、+(弱)、++(中度)、+++(强)； 染色范围为－(0%～5%)、+(6%～25%)，++(26%～50%)、+++(＞50%)。两种蛋白阳性表达结果中，(－)归为阴性表达组，(+)、(++)、(+++)归为阳性表达组。采用免疫印迹（Western blot）法测定各组织中 NF－κB 和 IκB－a 蛋白表达水平（灰度值＞15．0 为阳性）。

1．5 统计学方法 统计软件采用SPSS 16．0，采用均数±标准差（±s）进行统计描述，两组间比较采用t检验，三组间比较采用单因素方差分析法；计数资料组间比较采用χ2检验；图像分析系统(Image－pro Plus 6．0)计算 NF－κB 和 IκB－a 的积分光密度(Integral opticaldensity，IOD)。 P 值＜0．05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 两组组织标本中的 NF－κB 和 IκB－a 蛋白表达情况比较 AD组、对照组的NF－κB蛋白表达阳性率分别为 68．33%、18．00%（P＜0．001），见表 1。 IκB－a 蛋白阳性率分别为 20．00%、72．00%（P＜0．01），见表2。

表1 组织标本中的NF-κB蛋白表达情况比较

表2 组织标本中的IκB-a蛋白表达情况比较

2．2 NF－κB 和 IκB－a 蛋白印迹检测结果 NF－κB在 AD 组的表达水平为 32．33±0．7， 明显高于对照组的表达水平 （P＜0．05）；IκB－a 在 AD 组的表达水平为 15．22±0．3， 明显低于对照组的表达水平 （P＜0．05）。 见表 3。

表3 Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平比较

2．2 老年痴呆患者 NF－κB 和 IκB－a 蛋白表达与患者临床病理学特征的关系 NF－κB和IκB－a蛋白表达率和相对含量在不同的年龄、性别、恶化程度中，差异具有统计学意义（P＜0．05），见表 4。

3 讨论

目前，我国的老龄化趋势日益严重，老年痴呆的发病率亦上升明显，本病是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。老年痴呆是多种疾病因素相互作用而诱发，发病机制较为复杂，免疫假说、氧化应激假说、基因突变假说及胆碱功能低下假说均为当下较为流行的老年痴呆发病机制假说[7]。

表4 老年痴呆患者NF-κB和IκB-a蛋白表达与临床病理学特征的关系

研究[8]认为氧化应激损伤是导致老年痴呆患者认知功能障碍的最关键的因素之一，老年痴呆可诱发脑内出现一系列炎症和氧化应激反应，进而损伤神经元。NF－κB由氧化还原因子－1进行氧化还原调控的重要转录因子，可结合抑制蛋白I－κB家族而形成复合物进入细胞浆中[9]。经活化作用后I－κB与NF－κB出现解离而进入细胞核发挥基因表达的调节作用。资料[10]亦显示I－κB和NF－κB与细胞内的炎症反应关系密切，是一类重要的调节炎症反应的信号通路。本研究中老年痴呆患者脑脊液中NF－κB和IκB－a蛋白表达明显高于对照组的表达，差异具有统计学意义（P＜0．05）。 上述结果说明老年痴呆患者存在炎症反应并提示NF－κB和IκB－a蛋白具有老年痴呆早期诊断的重要疾病指标的潜力。

研究[11]发现NF－κB普遍存在于真核细胞中，是一种具有序列特异性的二聚体结构，可通过胞浆将信息传至细胞核而调节相关基因的表达。安静状态下，异源或同源二聚体NF－κB结合IκB－a蛋白而形成三聚体而以无活性状态存在细胞质中。外界因素刺激细胞后可激活蛋白激酶IκK并在其作用磷酸化IκB，经过泛素－蛋白激酶降解后分离NF－κB，激活NF－κB并将其移位至细胞核内，与DNA接触并形成环状结构，发挥抑制或启动基因转录的作用进而调节炎症反应[12]。

老年痴呆患者NF－κB和IκB－a蛋白表达与患者临床病理学特征的关系结果显示NF－κB和IκB－a蛋白表达与患者年龄、性别、和病情恶化阶段有关，差异具有统计学意义（P＜0．05）。 上述结果说明者NF－κB和IκB－a蛋白表达与老年痴呆患者的病情发展关系密切。NF－κB具有神经损伤和保护的双重作用，其中损伤作用主要取决于NF－κB产生的具体位置、产生量、活化信号（刺激物）、神经元所处位置和持续时间等多种因素。先前的研究[13]证实神经元突触、突触后及胞体致密层具有活性的NF－κB具有将突触信息传送至细胞核中的信使功能，认为NF－κB活化是导致神经元等许多类型细胞凋亡的主要机制之一。最新的研究[14，15]显示NF－κB发挥神经保护作用的机制可分为以下几点：⑴诱导锰过氧化物歧化酶的转录；⑵促进神经元凋亡抑制蛋白MAP的表达；⑶抑制谷氨酸受体亚单位的表达；⑷稳定细胞内钙和增加钙结合蛋白的转录； ⑸诱导凋亡抑制因子 Bcl－2、Bcl－xl的表达。经过研究我们认为对老年痴呆的治疗可通过调节 Ref－1－NF－κB－IκB 氧化还原通路为研究点，进而调节神经保护作用，提高老年痴呆患者的记忆能力，但具体结果还需要进一步研究证实。

综上所述，NF－κB 和 IκB－a 蛋白表达与老年痴呆发病具有密切的联系，有望成为检测老年痴呆的指标。