SHh、Ptch1蛋白表达水平变化与胰腺癌发生发展的相关性分析

张志勇

(许昌市人民医院消化内科，河南 许昌 461000)

胰腺癌的发生能够导致患者病死率的显著上升，胰腺癌的早期诊断水平较低，疾病的病情进展较为阴离子。流行病学研究显示，胰腺癌的发病率可达344～566/10万人左右[1]，且近年来在部位合并有胆道系统疾病的人群中，胰腺癌的发病率更高[2]。

分子生物学因子的改变，能够通过影响到恶性肿瘤早期发生过程中的细胞生物学特征，干预到癌细胞的增殖、凋亡及分化等病理过程。hedgehog信号通路能够通过激活癌细胞的转录，提高癌细胞的异常增殖的风险，导致恶性肿瘤的发生。Hh配体蛋白（SHh）、Hh 受体蛋白（Ptch1）均为 hedgehog信号通路上主要的核心效应蛋白，其主要表达中胚层组织、新生儿心肌细胞组织及部位平滑肌细胞组织中，近年来相关基础方面的研究显示，SHh、Ptch1蛋白能够促进胰腺上皮细胞或者腺体细胞的持续性DNA核的异常分裂，增加癌细胞的侵袭或者转移的风险，同时SHh、Ptch1蛋白还能够在促进肿瘤病灶新生血管的形成，增加肿瘤病灶的血流灌注等方面发挥作用，促进病情的进展[3，4]。 为了进一步探讨 SHh、Ptch1 蛋白等在促进胰腺癌发生发展过程中的作用，从而为临床上胰腺癌的血清学筛查提供依据，本次研究选取我院确诊的胰腺癌患者组织标本100例，探讨了相关指标的蛋白水平表达及其与胰腺癌患者临床病理特征的关系，报告如下。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选河南省许昌市人民医院2014年10月－2017年2月手术后胰腺癌组织标本100例（病灶组）、癌旁组织50例（癌旁组）。病灶组，年龄38～70 岁，平均年龄 53．41±12．57 岁，男性 49 例，女性51例；TNM分期Ⅰ期33例，Ⅱ期36例，Ⅲ期31例；分化程度：高分化38例，中低分化62例；无淋巴转移44例，有淋巴转移56例；对照组，年龄36～71 岁，平均年龄 52．46±13．15 岁，两组年龄差异无统计学意义（P＞0．05）。

1．2 纳入排除标准

1．2．1 纳入标准 ⑴术前未合并其他部位恶性肿瘤；⑵术后病理证实为胰腺癌；⑶手术根治性切除肿瘤，术后生存期大于1个月，未发生围术期并发症；⑷有完整规范的术后病理报告及随访资料；⑸术前未接受介入治疗、放化疗；⑹无高血压、糖尿病、肾炎、急慢性盆腔炎及子宫内膜异位症等疾病，近期均未服影响前列腺素和血栓素代谢的药物。

1．2．2 排除标准 ⑴合并其他系统严重疾病者；⑵未能完成随访者；⑶贫血及凝血功能障碍；⑷风湿及免疫系统疾病；⑸严重的肝肾功能疾病；⑹甲状腺功能障碍；⑺因其他部位肿瘤进行过放化疗治疗者。

1．3 免疫组化染色 所有组织标本经石蜡包埋后作连续切片，厚度约为4mm，采用免疫组化链霉卵白素一生物素复合体法 (strep avidin－biotin complex，SABC法)染色，二氨基联苯胺(diamionben zidene，DAB)显色。 SHh、Ptch1 蛋白抗体、PV6000 通用型二抗以及SP试剂盒和DAB显色盒均购自北京中杉金桥生物技术开发公司。以阳性片及PBS代替一抗分别作为阳性及阴性对照，高倍显微镜下观察SHh、Ptch1蛋白的表达情况，具体染色步骤严格按照SP试剂盒说明书进行操作。

1．4 免疫组化判定标准 免疫组化结果判定：以在呈现清晰的棕黄色颗粒为阳性，按阳性细胞所占比例数分为： 染色强度分为－(阴性)、+(弱)、++(中度)、+++(强)； 染色范围为－(0%～5%)、+(6%～25%)，++(26%～50%)、+++(＞50%)。 两种蛋白阳性表达结果中，(一)归为阴性表达组，(+)、(++)、(+++)归为阳性表达组。

1．5 蛋白检测方法及结果分析 Western blot检测蛋白的相对表达量：冰上分离出组织，置于预冷的研钵中液氮研磨至粉末状。按4：l（缓冲液：样品蛋白）的比例加上样缓冲液，每条泳道加20ul缓冲液稀释的样品，于60V电压下跑胶，脱脂蛋白封闭2h， 羊抗 SHh、Ptch1 蛋白抗体 （浓度 1：1000），2h后加入二抗（浓度 1：200）。 Image pro plus 4．01 版本的专业图像分析软件 （购自上海精密仪器有限公司）进行图像分析，SHh、Ptch1蛋白抗体购自罗氏检测公司。

Western Blot结果分析：把各自的灰度值都用内参校正，得到蛋白的相对含量。

1．6 统计学方法 统计软件采用SPSS 17．0，采用均数±标准差（±s）进行统计描述，两组间比较采用t检验；计数资料组间比较采用χ2检验；P值＜0．05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 两组组织标本中SHh、Ptch1蛋白的表达情况比较 病灶组、对照组的SHh蛋白表达阳性率分别为 68．00%、10．00%（P＜0．001）。 病灶组、 对照组的Ptch1 蛋白表达阳性率分别为 65．00%、6．00%（P＜0．001），见表 1、表 2。

表1 组织标本中SHh蛋白表达情况比较

表2 组织标本中Ptch1蛋白表达情况比较

2．2 两组组织标 SHh、Ptch1蛋白印迹检测结果病灶组SHh、Ptch1蛋白量与癌旁组相比差异具有统计学意义（P＜0．05），见表 3。

表3 SHh、Ptch1蛋白表达水平比较

2．3 胰腺癌组织标本中的SHh、Ptch1蛋白表达与患者临床病理学特征的关系 中低分化胰腺癌组织Shh、Ptch1蛋白平均表达率高于高分化胰腺癌组织Shh、Ptch1蛋白率，差异具有统计学意义（P＜0．05）；SHh、Ptch1 蛋白表达与患者年龄、性别、TNM分期、淋巴结转移无关（P＞0．05），见表 4。

3 讨论

胰腺癌的发病病因较为复杂，一般认为基因水平或者胆道系统基础性疾病可能是促进胰腺癌发生的主要因素[5，6]。近年来，越来越多的研究显示，基因调控或者分子生物学水平的改变，是促进胰腺癌发生的又一重要因素。分子谱相关水平的波动，能够在影响到癌细胞的生物学特征、增强癌细胞细胞周期的调控，促进免疫逃逸、抑制机体的T淋巴细胞免疫反应等，进而协助肿瘤的浸润或者转移[7，8]。本次研究通过对于 Shh、Ptch1蛋白等生物学因子与胰腺癌发病的关系研究，特别是对于Shh、Ptch1蛋白与胰腺癌临床病理特征的关系研究，能够为临床上胰腺癌的早期高危筛查提供潜在的分子参考。

SHh、Ptch1蛋白能够增强胰腺腺体上皮细胞基因错配的几率，诱导癌基因的点突变的发生风险。SHh与其配体结合后，能够诱导低氧环境，增加癌细胞的持续性DNA分裂的风险。SHh蛋白结构上包含的多个可结合的巯基结构，能够促进患者体内的癌细胞膜表面的糖蛋白的激活，增加癌细胞内的肿瘤相关信号通路如AKT等的上调，增加癌细胞分化凋亡障碍[9，10]。Ptch1蛋白作为受体水平的糖蛋白分子，其与相关配体结合后，能够增加胰腺细胞内的肿瘤易感分子的携带风险，导致癌细胞的早期T淋巴细胞的免疫逃逸，影响到机体的免疫监察作用[11，12]。部分研究揭示了hedgehog信号通路相关信号效应分子对于消化道系统恶性肿瘤或者生殖系统恶性肿瘤的发生的影响作用，认为SHh、Ptch1蛋白能够显著促进癌细胞对于临近正常组织的浸润及扩散的风险。

表4 胰腺癌组织Shh、Ptch1蛋白表达与临床病理因素的关系

本研究通过免疫组化分析研究及蛋白定量水平的相关表达分析发现，SHh、Ptch1蛋白的表达阳性率或者表达浓度均明显高于胰腺良性病变组或者对照组，差异具有统计学意义，提示SHh、Ptch1蛋白能够在促进胰腺癌发生过程中发挥一定的作用，SHh、Ptch1蛋白在胰腺组织中的异常表达能够通过影响到下列几个方面的因素，导致胰腺腺体上皮细胞异型性及细胞核异常病变的发生[13，14]：⑴SHh蛋白对于胰腺腺体上皮细胞粘附能力的改变，不仅能够促进粘附分子adherin 1的表达上升，同时能够促进胰腺细胞间质成分的分解，为胰腺癌的早期脏器内部的转移提供依据；⑵Ptch1蛋白通过对于AKT或者MAPK等信号通路的激活作用，能够降低血管内皮钙粘素的表达，提高癌细胞通过上皮间质转换进行转移的风险。赵一鸣等[15]研究者在分析了83例样本量的胰腺癌患者的癌基因相关分子谱后发现，Ptch1蛋白或者其他hedgehog信号通路效应蛋白的表达浓度改变，是促进患者治疗预后恶化、治疗后的复发率的上升等结局发生的重要因素。部分研究者认为hedgehog信号通路相关效应分子的表达与胰腺癌患者的淋巴结浸润或者临床分期等主要临床病理特征密切相关，但本次研究并未发现相关结论，考虑可能与样本量的正态分布偏移有关，但也不排除与SHh、Ptch1蛋白等的表达确实难以影响到癌细胞对于淋巴结内皮组织的粘附等过程。在中低分化胰腺癌组织中，相关蛋白的表达阳性率较高，提示相关蛋白的异常表达与胰腺癌细胞的细胞分化障碍具有密切的关系，这可能与SHh、Ptch1蛋白等对于癌细胞分化诱导cyc－m的调控作用有关。

综上所述，SHh、Ptch1蛋白在胰腺癌组织中高表达，并且与胰腺癌的细胞分化程度具有密切的关系。