扬州市乙型肝炎病毒B基因型前S基因特征分析

肖越胜 ，张军 ，唐阳 ，杨立坤 ，张晋

(1、扬州市医学检验中心，江苏 扬州 225001；2、扬州市疾病预防控制中心，江苏 扬州 225001)

人乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）属嗜肝DNA病毒科，基因组是不完全闭合环状双链DNA，长度约3．2kb，有四个部分重叠的开放式阅读框（ORF），前 S/S 区（PreS/S）、PreC/C、Pol、X。 其中PreS/S区编码大、中、小3种包膜蛋白。HBV序列异质性是一个特征，源于其较高的病毒复制产量及突变率，该突变是由于在逆转录过程中缺乏校对的酶而造成的。长期的自发性突变使基因序列产生差异，依据HBV DNA全序列的核苷酸差异，共分 A－I九个基因型[1，2]。HBV 基因型中存在混合感染的现象和明显的地域分布，我国HBV感染以 B和 C型为主，占 90%以上[3，4]，南方以 B和 C型为主，A型和D型在我国东部地区有少量存在。HBV在复制过程中催化逆转录过程的酶缺乏3’－5’核酸外切酶活性，从而缺乏校正功能，不能修正在外界选择压力改变下C、S区等产生的变异，使其抗原性减弱，产生免疫逃逸现象。目前有关HBV S区基因变异与乙肝疫苗免疫失败、肝移植乙肝免疫球蛋白逃逸、隐匿性HBV感染等方面的研究较多[5，6]。扬州市HBV感染以基因B、C型为主[7]，但在感染过程中病毒的前S基因变异和特征目前未有报道。

1 材料与方法

1．1 样本来源 样本采自本中心门诊，静脉采血，3000rpm离心，取血清进行乙型肝炎病毒核酸(HBV－DNA)荧光PCR检测，留取核酸阳性样本－70℃冻存备用。

1．2 试剂和仪器 HBV DNA荧光定量PCR，艾肯生物技术有限公司（杭州）；Viral Nucleic Acid Iso鄄lation Kit，江苏硕世生物科技有限公司；PreS引物，生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR试剂，宝生物工程（大连）有限公司；普通PCR仪和电泳仪，美国BIO－RAD公司。

1．3 研究方法

1．3．1 血清荧光PCR检测，取具有典型荧光扩增曲线的标本，按文献[7]进行基因分型，取基因B型病毒 7株 YZ01－YZ07，其中 YZ01－YZ04病毒载量大 于 105copies/ml，YZ05－YZ07 病 毒 载 量 小 于105copies/ml。

1．3．2 PreS PCR 引物， 采用 DNAStar PrimerSelect设计HBV PreS基因区间通用引物，上游引物YZS－A：5′－cgaaaaggcatggggacaaatc(nt2872－2983)；下游引物 YZS－B：5′－ggagccaccagcaggaaagta(nt49－70)， 产物 414bp。 扩增条件：94℃ 1min；98℃ 10s，60℃ 15s，68℃ 30s，35 个循环。

1．3．3 PreS 基因扩增片段，1．5%琼脂糖凝胶电泳，扩增产物送南京金斯瑞公司进行测序。

1．3．4 基因分析 参考序列为从GenBank下载的HBV A－H基因型的序列，分别为A基因型：X51970；B 型 ：033554，AB073858，AF121244，AF100309，D00329；C 型 ：AB014381，AB033556，AF068756，X04615；D 型 ：M32138，X65259；E 型 ：AB032431，X75657；F 型 ：AB036910，X69798；G型 ：AB064310，AF160501；H 型 ：AY090454，AY090457。20条参考序列与研究样本序列用BioEdit软件对齐，DNAStar MegAlign软件Clustal W比对构建距离矩阵，采用neighbor－joining法构建系统发生树。

1．3．5 将研究样本序列和基因 B型参考序列(nt2926－70)用EditSeq翻译成氨基酸序列后，输入MegAlign比对。翻译的氨基酸序列共120AA，对应表位是 PreS：AA27－146。

2 结果

2．1 PreS片段PCR结果 将已分型的7株病毒核酸进行PreS基因片段扩增，产物经1．5%琼脂糖凝胶电泳，显示扩增结果与设计扩增片段大小相符，证明PCR扩增模板为HBV DNA（见图1）

图1 PCR产物凝胶电泳图

2．2 同源性分析 扩增产物测序成功6条。将所测PreS基因片段序列和20条参考序列经软件比对，得出基因比对矩阵。扬州市6例样本间同源性分别为 97．2%～98．6%，其中 YZ07 与 YZ02、03 同源最高为 98．6%，与 YZ06 最低为 97．2%，与同基因型参考株的同源性为：92．8%～100%。参考序列033554与研究样本间同源性为：92．8%～94．8%，与 YZ06 的同源性最低为92．8%，低于其他基因B型参考序列。参考序列AF121244与研究样本间同源性高于其他基因B参考序列，与YZ03的同源性最高为100%，。研究样本与其他基因型参考株间的同源性为：78．1%～86．2%，与基因 H 型的同源性最低。

2．3 遗传进化分析 将测序结果和参考序列共26条序列对齐后构建系统发生树，结果显示26条序列分成8个分支，分别对应A～H 8个基因型 （图2）。扬州6株序列与B型参考序列在一个大分支上，证明所选样本均为HBV基因B型。其中YZ01、02、06、07 与 AF121244、AF100309 在同一小分支上，遗传距离较近，YZ03、04各在单一的小分支上，与其他序列无共用分支。另3株B型参考株在其他分支上，与研究样本的遗传距离较远。

2．4 PreS基因突变位点 扬州6株序列和在同一小分支上同源性最高的基因B型参考序列AF121244按1．3．5方法比对后发现存在缺失和突变现象。YZ07发现有4个突变位点，YZ06有3个突变位点，YZ01有1个突变位点，6例研究样本中3例发生突变，分别为PreS：AA39．YZ06缺失谷氨酸，AA44．YZ07天冬氨酸由天冬酰胺替代(D→N突变)，AA45．YZ07亮氨酸由苯丙氨酸替代 （L→F突变），AA78．YZ07丝氨酸由天冬酰胺替代 （S→N突变），AA108.YZ07亮氨酸由苯丙氨酸替代（L→F突变），AA109.YZ01和YZ06丝氨酸由苏氨酸替代（S→T突变），AA114.YZ06天冬氨酸由缬氨酸替代（D→V 突变）。 YZ02、03、04与参考序列比对未发现突变。

图2 扬州市6株病毒与20条参考序列构建系统发生树

3 讨论

人乙型肝炎病毒的流行在扬州以基因B和C型为主，本研究发现，扬州市HBV B基因型间同源性高，所研究样本之间的同源性高于与参考株间的同源性，且在遗传进化树中，与AF121244和AF100309的在同一小分支上，表现为较强的亲缘关系，说明扬州HBV间遗传距离近，流行地域特征明显。

S 区分为 PreS（preS1、preS2)和 S 基因，分别编码表面蛋白的大蛋白、中蛋白和主蛋白，其中大蛋白对HBV的感染吸附起关键作用。PreS基因包含许多B或T细胞表位并发挥多种功能[8]。因此PreS基因的突变会引起病毒外壳蛋白组成的改变，影响到B或T细胞的识别，影响到免疫系统对病毒的识别，是传统疫苗产生免疫失败主要原因[9]。人类白细胞抗原 (HLA)-I类分子结合来自胞内加工的肽段，因此这些分子提供消除胞内病毒并在胞内浸润的CD8+T细胞[10]。到目前为止人们已在8种HBV基因型中发现60种HBV特异性的HLAI限制性表位和32种HBV特异性的HLA-Ⅱ限制性表位[11]。许智慧[12]发现乙肝患者HBV PreS/S的表位变异降低了病毒对CTL(细胞毒性T细胞)结合的亲和力，S区中S基因为保守区域，其变异率较低，而PreS1基因的变异率高于S基因。本研究的6株样本发现PreS基因有7个位点发生突变，存在较高的突变率。PreS基因突变率随着肝病的进程呈现明显递增的趋势，基因突变促进了肝病的进展[13]。因HBV不同位点的缺失和突变的意义不同，对肝病的进程和病毒免疫都有重要影响，研究不同位点的突变对临床和被动免疫有重要作用。扬州6株PreS区氨基酸的突变为点突变，且氨基酸替代未改变极性，所以蛋白质抗原性未发生改变。低病毒载量YZ06、YZ07发现7个突变点，而高病毒载量病毒株仅YZ01存在1个，低于王社梁等[14，15]的研究，这或许与肝炎病毒是否处于活动期、病情所处阶段以及是否长期服药等有一定的关系。突变积累以及氨基酸替换的点位是否会影响本地的被动免疫，有待进一步观察。由于本次研究样本数较少，影响突变位点和氨基酸替换率统计，未发现突变优势株，不能明确基因型与临床表型之间的关系。研究发现的突变是否对临床有意义，有待以后研究。