脑苷肌肽改善糖尿病大鼠空间记忆能力研究

刘 波，刘文强，左中夫，2

糖尿病认知功能障碍(diabetic cognitive dysfunction, DCD)是由糖尿病糖代谢紊乱所导致[1]，表现为记忆力减退、学习能力下降，语言能力、理解力、定向力等能力均受到不同程度的影响[2]。目前尚缺乏特效的治疗措施，现代医学治疗以降血糖、减轻胰岛素抵抗和营养脑神经等综合治疗为主[3]。脑苷肌肽为国际上公认的，可从根本上修复受损神经，促进细胞再生，恢复神经生理功能的特效药[4]，与脑细胞生长发育、学习记忆等功能关系密切[5-7]，有望应用于糖尿病认知功能障碍的治疗。本研究以健康成年SD大鼠为研究对象，通过建立糖尿病大鼠模型，观察脑苷肌肽治疗后，糖尿病大鼠空间记忆能力的行为学改变，收集血清及海马组织分析导致这种改变的具体机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1实验分组选取健康SD成年大鼠40只，雄性，5月龄，体质量180～200 g。大鼠1笼5只，自由饮水进食。将大鼠随机分为5组：脑苷肌肽低剂量组(0.2 mL·kg-1)、脑苷肌肽中剂量组(0.6 mL·kg-1)、脑苷肌肽高剂量组(1.8 mL·kg-1)、糖尿病模型组和空白对照组，每组10只。

1.2缓冲液配置取2.101 g柠檬酸与2.941 g柠檬酸钠各溶于100 mL蒸馏水中，分别配置成0.1 mmol·L-1溶液，再按照1∶1.32比例将柠檬酸溶液于柠檬酸钠溶液混合，配置成0.1 mmol·L-1，pH4.5的缓冲液。

1.3糖尿病大鼠模型建立采用链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)一次性大量腹腔注射，建立大鼠糖尿病模型。所有大鼠适应性喂养7 d后，禁食12 h。脑苷肌肽干预组、糖尿病模型组以60 mg·kg-1腹腔一次性注射STZ。对照组注射等量枸橼酸钠缓冲液。所有大鼠均在同一动物房内分笼饲养，给予标准饮食。连续喂养2周后，测定血糖、尿糖及尿量，血糖≥16.7 mmol·L-1为建模成功。

1.4糖尿病大鼠空间记忆能力的行为学观察造模12周后用Morris水迷宫及Y迷宫测试大鼠。Morris水迷宫及Y迷宫适应性训练，每日1次，每次120 s，适应性训练3 d后正式进行Morris水迷宫及Y迷宫测试。①Morris水迷宫试验：试验前将大鼠置于站台上适应10 s，再将大鼠随机从不同象限面壁置入池内，大鼠登上站台5 s后终止记录，最长记录时间120 s，大鼠在120 s内无法上台，引导大鼠登上站台适应10 s，再将大鼠擦干放入鼠笼。每日训练4次，每次间隔1 h。测量平台象限游泳时间、平台象限游泳路程占总路程百分比、第1环点数、总得分。训练3 d后，在第4、5天进行实验测试，测试时间为每只120 s。②Y迷宫试验：将大鼠放入迷宫，适应5 min，再将大鼠放入某一臂作为起步区进行电击，触电后10 s内一次性跑向安全区为正确反应，每次测试间隔30 s，依次重复至大鼠学会为止。学会标准为连续10次电击有9次正确反应，否则为未学会。第2天进行正式测试，每只大鼠测试30次，记录自发性探索行为正确率、各臂次数总和及自发变换行为百分比。小鼠后肢完全进入臂内未完成1次进入，连续进入3个不同的臂通号，为完成1次自发变换行为。

1.5血清神经元特异性烯醇化酶与S-100B蛋白的表达 分别于治疗前、治疗2周后，取空腹静脉血3 mL，3 000 r·min-1离心10 min 收集血清，-70 ℃冷冻保存，检测血清神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)与S-100B蛋白的表达。采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测，严格按照试剂盒(美国BPB Biomedicals)操作说明进行操作。

1.6胰岛素样生长因子的表达采用ELISA法检测胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF) IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR。按ELISA试剂盒(上海纪宁)操作，4 ℃保存，镜下拍照判读结果。每只大鼠取有海马CA3区的5张不同断面切片进行免疫组化染色，光镜下随机选取5个高倍镜视野，计数阳性细胞占总细胞比例，观察染色强度，以ImagePro软件进行图像分析。以棕黄色染色细胞数比例大于30%、染色强度为阳性，判读为阳性。

1.7统计学分析采用SAS 9.0统计软件分析试验数据，多组间计量资料比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。多组间计数资料比较采用卡方检验。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1Morris迷宫糖尿病大鼠空间记忆能力测试结果，糖尿病模型组平台象限游泳时间、平台象限游泳路程占总路程百分比、第1环点数、总得分均显著低于正常对照组。经脑苷肌肽治疗后，平台象限游泳时间、平台象限游泳路程占总路程百分比、第1环点数、总得分与糖尿病模型组相比，差异有统计学意义(均P<0.05)。随着脑苷肌肽剂量的升高，上述指标逐渐升高(均P<0.05)，见表1。

表1 Morris迷宫糖尿病大鼠空间记忆能力测试

注：①与模型组相比，P<0.05；②与对照组相比，P<0.05。

2.2Y迷宫糖尿病大鼠空间记忆能力测试结果糖尿病模型组自发性探索行为正确率、行为变换百分比、各臂次数总和显著低于正常对照组。经脑苷肌肽治疗后，自发性探索行为正确率、各臂次数总和显著高于糖尿病模型组，随着脑苷肌肽剂量的升高，上述指标逐渐升高(均P<0.05)。各组行为变换百分比差异无统计学意义(均P>0.05)，见表2。

表2 Y迷宫糖尿病大鼠空间记忆能力测试

注：①与模型组相比，P<0.05。②与对照组相比，P<0.05。

2.3血清NSE与S-100B蛋白表达情况糖尿病模型组血清NSE、S-100B水平显著高于正常对照组。经脑苷肌肽治疗后，血清NSE、S-100B水平显著低于糖尿病模型组，随着脑苷肌肽剂量的升高，上述指标逐渐下降(均P<0.05)，见表3。

表3 血清NSE、S-100B表达情况 μg·L-1

注：①与模型组相比，P<0.05；②与对照组相比，P<0.05。NSE:神经元特异性烯醇化酶。

2.4免疫组化检测IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR表达糖尿病模型组中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR阳性表达率显著低于对照组。经脑苷肌肽治疗后，脑苷肌肽高剂量组IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR阳性表达率显著高于糖尿病模型组(均P<0.05)，见表4。

表4 各组IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR表达情况例(%)

注：①与模型组相比，P<0.05；②与对照组相比，P<0.05。

3 讨论

近年来，随着我国人民生活水平提高，饮食结构改变，糖尿病发病率呈逐年上升趋势，其中大多数为2型糖尿病[8]。长期高血糖状态，可对中枢神经系统功能造成不良影响，以认知功能障碍最为常见。认知功能即机体认识、获取并加工信息的心理过程，为大脑处理高级活动的能力，包括学习、语言、注意、记忆、计算、定向和执行力等[9-10]。临床报道显示，2型糖尿病患者认知功能损害程度较正常人高2倍以上[11]。2型糖尿病患者持续高血糖状态可导致中枢神经系统功能损伤而影响大脑认知功能，可使患者出现痴呆、生活自理能力下降、糖尿病自我监测能力和生活质量下降等[12]。由此可见，随着老龄化及糖尿病患者增多，糖尿病认知功能障碍愈发不可忽视。

脑苷肌肽为多肽、多种神经节苷脂的复合制剂，小分子多肽为神经细胞的基本物质之一，也是神经系统的营养物质，与脑细胞生长发育与学习记忆等功能关系密切[13]。神经节苷脂存在于哺乳动物中枢神经，尤其是神经元细胞的细胞膜中，可促进中枢神经系统生长发育及脑功能恢复[14]。临床报道显示脑苷肌肽可通过多种途径发挥治疗神经系统疾病的功能，包括：①通过激活神经生长因子，提供充足营养及能力，促进轴突生长、突触形成，提高神经细胞的存活率，促进神经再生。②显著减少损失后大脑半球的缺血梗死灶，提高血红蛋白的载氧能力，改善脑组织缺血、缺氧，改善脑能量代谢。③可透过血脑屏障进入神经细胞膜，激活、保护细胞膜离子泵系统，纠正离子紊乱，防止神经细胞内钙离子积聚，恢复调制神经系统正常电生理功能。糖尿病认知障碍患者由于存在明显的中枢神经系统损伤，应用脑苷肌肽恢复受损的神经细胞，理论上具有可行性。

为探讨脑苷肌肽治疗糖尿病认知功能障碍的具体机制，本研究通过行为学观察初步证实脑苷肌肽可用于糖尿病认知障碍的临床治疗中。研究结果显示，Morris迷宫提示糖尿病模型组平台象限游泳时间、平台象限游泳路程占总路程百分比、第1环点数、总得分均显著低于正常对照组。提示糖尿病模型组普遍存在空间记忆能力下降。经脑苷肌肽治疗后，平台象限游泳时间、平台象限游泳路程占总路程百分比、第1环点数、总得分显著提高。随着脑苷肌肽剂量的升高，上述指标逐渐升高。说明脑苷肌肽具有改善大鼠空间记忆能力的作用，且随着药物使用剂量的增加，改善效果也逐渐增强。Y迷宫的结果与Morris迷宫结果类似，糖尿病模型组自发选择性行为的空间记忆能力较对照组显著下降，经脑苷肌肽治疗后，空间记忆能力显著提高，且与剂量呈正相关，表现为自发选择性探索行为正确率、行为变换百分比、各臂次数总和显著提高。

进一步证实脑苷肌肽改善糖尿病大鼠空间记忆能力的具体机制，本研究分别取大鼠血清及海马CA3区组织为研究对象，观察血清中NSE、S-100B水平及IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR表达情况。其中NSE和S-100B是临床常用神经特异性标志物，其中NSE定位于神经元及神经内分泌细胞中，为糖酵解中的关键酶，正常情况下血清中含量很低，神经胶质细胞及其他脑神经组织中不含NSE[15]。神经元坏死，NSE可漏至细胞外间隙，使体液中含量增加。血液及脑脊液中NSE浓度变化与脑损伤呈正相关，可反映神经元损伤的严重程度及梗死灶大小，也是预后的预测指标之一。S-100B为酸性钙结合蛋白，主要分布于中枢神经系统的神经胶质细胞与雪旺式细胞，水平变化可反映脑胶质细胞损伤的严重程度。有研究发现S-100B浓度升高的患者都存在不同程度的认知功能障碍[16]。二者联合检测，可以比较准确地反映早期脑组织的损害情况。糖尿病模型组血清NSE、S-100B水平显著高于正常对照组，说明糖尿病大鼠中存在明显的认知功能障碍，经治疗后血清NSE、S-100B水平显著下降，说明脑苷肌肽可通过降低血清NSE、S-100B水平来发挥改善认知功能障碍的作用。

临床报道显示[17]，海马为神经中枢记忆回路的重要结构，与认知功能存在密切关系。研究表明[18]海马对高血糖较敏感，2型糖尿病患者在慢性高血糖刺激下，海马神经元数量减少、形态异常或功能失调，可导致相关的学习、认知功能障碍。海马区与认知功能障碍与胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、胰岛素样生长因子-Ⅰ受体(IGF-ⅠR)密切相关。IGF-Ⅰ为具有多种生理功能的活性多肽[19]，可抑制神经元凋亡，调节乙酞胆碱的合成、释放，抑制蛋白的过度磷酸化[20]。IGF-ⅠR为细胞膜表面的糖蛋白，在认知功能障碍患者的额叶皮质、海马和下丘脑部位，IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR表达显著减少[21]。基于此，本研究选择海马CA3区组织行免疫组织化学检测IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR表达情况，结果显示，糖尿病模型组中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR阳性表达率显著低于对照组。经脑苷肌肽治疗后，IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR阳性表达率显著升高，且随着脑苷肌肽剂量升高，IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR阳性表达率也显著升高。说明脑苷肌肽可通过激活IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR表达，发挥治疗糖尿病大鼠认知功能障碍的作用。

综上所述，脑苷肌肽可显著改善糖尿病大鼠空间记忆能力，机制可能与降低血清NSE、S-100B水平，提高海马中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR蛋白水平有关。